【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化是目前危害人類健康的主要病變之一,目前多項(xiàng)研究提示血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的起始步驟,且在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。目前多項(xiàng)研究亦發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,如促進(jìn)損傷內(nèi)皮修復(fù)等,Walter等研究發(fā)現(xiàn)血循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有向球囊損傷血管部位歸巢的特點(diǎn),大量證據(jù)表明EPCs水平與血管危險(xiǎn)因素有較強(qiáng)的相關(guān)性,甚至優(yōu)于Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,臨床研究也證實(shí),機(jī)體內(nèi)循環(huán)EPCs數(shù)量的增加和功能的改善對(duì)冠心病、心力衰竭等心血管疾病的治療有重要意義。然而動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素如高齡,高血壓,高膽固醇血癥,糖尿病等,都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的EPCs數(shù)量減少和影響的EPCs活性。 脂聯(lián)素主要是由白脂肪組織合成的分子量是30kDa蛋白,其具有胰島素增敏、抗動(dòng)脈粥樣和抗炎特性。促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生以及減輕活性氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷�？傊�,脂聯(lián)素通過(guò)激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在血管保護(hù)中發(fā)揮著舉足輕重的作用。脂聯(lián)素在循環(huán)中主要有三個(gè)亞型：低分子量的三聚體,中等分子量的六聚體和高分子量的多聚體。這三種亞型各有不同的功能,其中研究表明高分子量是主要的活性蛋白。在內(nèi)皮細(xì)胞上主要有兩種脂聯(lián)素受體,即R1和R2受體。內(nèi)皮是脂聯(lián)素的主要靶點(diǎn),脂聯(lián)素通過(guò)其在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體可以抑制單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞,并最終抑制血管平滑肌的遷移和增殖,這有助于減輕血管損傷。 骨髓和外周血的內(nèi)皮祖細(xì)胞是單核細(xì)胞前體細(xì)胞,能夠分化成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞通過(guò)歸巢定位到損傷部位加速再內(nèi)皮化,促進(jìn)血管修復(fù),在維持血管內(nèi)皮完整性,修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)新生血管形成及組織修復(fù)等方面起重要作用。EPCs主要來(lái)源于骨髓、外周血及臍血,脂肪中也存在少量的EPCS。外周血循環(huán)中EPCs的數(shù)量占外周血細(xì)胞總數(shù)的0.01%,占白細(xì)胞總數(shù)的0.05%,而骨髓中EPCs的含量是外周血的500倍。EPCs經(jīng)藥物刺激后可以提高至占白細(xì)胞總數(shù)的6%。EPCs促進(jìn)血管的生成及修復(fù)的機(jī)制可能有兩種：(1)直接分泌VEGF等細(xì)胞因子,通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)局部缺血組織的血管新生；(2)通過(guò)歸巢效應(yīng)、整合于受損的血管,直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管新生。 動(dòng)脈粥樣硬化的血管重塑及病理生理涉及多種細(xì)胞類型和級(jí)聯(lián)反應(yīng)。值得注意的是,PI3K/Akt信號(hào)通路是參與這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的部分環(huán)節(jié)。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通過(guò)不同類型的膜受體(包括G-蛋白耦合受體和酪氨酸激酶受體)激活蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。PI3K和Akt是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的重要的正調(diào)節(jié)子,通過(guò)L-精氨酸的依賴NADPH氧化產(chǎn)生NO。PI3K/Akt通路與內(nèi)皮細(xì)胞功能,如調(diào)節(jié)血管張力等密切相關(guān)。 本研究旨在探討內(nèi)皮祖細(xì)胞降低是否是動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素?與腦動(dòng)脈粥樣硬化狹窄病變血管數(shù)量和程度的相關(guān)性,進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號(hào)通路在脂聯(lián)素促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移中的作用。 第一章內(nèi)皮祖細(xì)胞與腦動(dòng)脈粥樣硬化程度的相關(guān)性研究 目的： 中風(fēng)仍然是成人死亡和長(zhǎng)期殘疾的主要原因,而缺血性中風(fēng)約占這些中風(fēng)的87%。腦動(dòng)脈粥樣硬化疾病是缺血性中風(fēng)的主要病因,血管內(nèi)皮功能障礙在其發(fā)生和發(fā)展上占主導(dǎo)作用。動(dòng)脈粥樣硬化早期的一個(gè)重要特點(diǎn)是內(nèi)皮功能障礙,而內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞逐漸喪失,促進(jìn)斑塊的發(fā)生和發(fā)展。但成熟的內(nèi)皮細(xì)胞再生能力有限。因此,越來(lái)越多的證據(jù)表明血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可以向血管內(nèi)皮層歸巢、修復(fù)損傷的內(nèi)皮并維護(hù)血管內(nèi)皮功能,這是通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的新的內(nèi)源性血管修復(fù)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 最近的研究表明,內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠歸巢到受損的內(nèi)皮細(xì)胞,分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞和替換受損的內(nèi)皮細(xì)胞,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈硬化的作用。因此,循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量是心血管健康狀況的標(biāo)志。最近的研究表明,循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)目減少與不同程度的心血管疾病的危險(xiǎn)因素密切相關(guān),如吸煙、糖尿病、高脂血癥和高血壓等。Werner等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病和外周閉塞性血管的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。然而,腦動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重性和內(nèi)皮祖細(xì)胞水平之間的關(guān)系還未知。在此背景下,本研究試圖探討內(nèi)皮祖細(xì)胞與腦動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度之間的關(guān)系,以及EPCs與傳統(tǒng)的心血管危險(xiǎn)因素(年齡,性別,吸煙,高脂血癥,高血壓,糖尿病,家族史)相關(guān)的程度。最后,進(jìn)一步評(píng)估內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)腦動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)價(jià)值是否優(yōu)于傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素。 方法： 1.入組南京軍區(qū)南京總醫(yī)院2011年12月至2013年12月之間的接受全腦血管造影的患者,并獲取人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和基線資料。所有患者均接受常規(guī)心電圖、心臟超聲檢查及數(shù)字減影血管造影(DSA)等檢查。神經(jīng)功能缺損采用NIHSS評(píng)分,心血管危險(xiǎn)因素綜合評(píng)分和下肢動(dòng)脈硬化程度判斷分別采用佛明漢評(píng)分(Framingham risk score, FRS)和踝肱指數(shù)(Ankle-brachial index, ABI)。 2.動(dòng)脈硬化負(fù)荷評(píng)估：按照動(dòng)脈硬化病變的位置分為單純顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄(intracranial atherosclerotic stenosis, ICS)組、單純顱外動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄(extracranial atherosclerotic stenosis, ECS)組、(combined intracranial and extracranial atherosclerotic stenosis, CCS)組。顱外狹窄是使用北美癥狀性頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)試驗(yàn)(NASCET)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,而顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄(ICS)參考WASID標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷分別從兩方面進(jìn)行評(píng)估：1、數(shù)量：計(jì)算動(dòng)脈硬化病變血管節(jié)段的數(shù)量(即狹窄≥50%的血管節(jié)段的總數(shù)目)；2、按照腦動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度來(lái)評(píng)估,0分代表50%的狹窄,1分代表50%至99%的狹窄和血管閉塞是2分。在一個(gè)動(dòng)脈段有多個(gè)病灶存在的情況下,按照最嚴(yán)重狹窄來(lái)計(jì)算。 3.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPPS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。對(duì)連續(xù)變量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)或方差分析,對(duì)于分類變量采用卡方檢驗(yàn)或Fisher分類變量的精確檢驗(yàn)。單因素分析P0.2的變量做為候選入多因素logistic回歸分析。動(dòng)脈硬化嚴(yán)重程度和內(nèi)皮祖細(xì)胞水平的數(shù)量之間的相關(guān)采用Spearman秩和相關(guān)分析。內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和動(dòng)脈鈣化或CAD嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性進(jìn)行了評(píng)估用多變量logistic回歸。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.基線資料特征 入組患者的年齡均值為60歲,29.4%的女性和12.2%無(wú)腦動(dòng)脈粥樣硬化者作為對(duì)照組。單純顱外動(dòng)脈狹窄54例(27.4%),單純顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄45例(22.8%). CD34+/CD309+, CD133+/CD309+和CD34+/CD133+/CD309+細(xì)胞中位值分別為0.172%(四分位距為0.066%至0.370%),0.131%(四分位距為0.041%至0.297%)和0.024%(四分范圍,分別為0.005%至0.063%)。 2.內(nèi)皮祖細(xì)胞與腦動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷負(fù)相關(guān) 校正混雜因素(如年齡、吸煙、高血壓、收縮壓和纖維蛋白原)后,內(nèi)皮祖細(xì)胞水平與腦動(dòng)脈粥樣硬化之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(CD45-/dimCD34+CD309+cells: B=-2.197, OR=0.111,95%CI:0.024to0.511, P=0.005; CD45-/dimCD133+CD309+cells:B=-2.172, OR=0.114,95%CI:0.023to0.556, P=0.007; CD45-/dim CD34+CD133+CD309+cells:B=-4.580, OR=0.010,95%CI:0.000to0.541,P=0.024)。進(jìn)一步多元logistic輯回歸顯示,只有內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)與顱外及混合腦動(dòng)脈粥樣硬化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而,內(nèi)皮祖細(xì)胞與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.腦動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷與EPCs和佛明漢評(píng)分相關(guān)性 受試者按動(dòng)脈粥樣硬化得分的三分位間距分為：低、中和高組。我們對(duì)EPCs的三種亞型通過(guò)順序逐步回歸分析提示,纖維蛋白原和高血壓是腦動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素,而皮祖細(xì)胞是保護(hù)因素。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)分析來(lái)分析動(dòng)脈硬化負(fù)荷和EPCs的相關(guān)性：在78位顱外動(dòng)脈硬化與對(duì)照組間相關(guān)分析提示CD133+/CD309+細(xì)胞與動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷之間相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(病變血管段數(shù)量和動(dòng)脈硬化狹窄度評(píng)分：Spearman rho=-0.195和-0.197,P0.05)。在69例顱內(nèi)狹窄患者中CD133+/CD309+細(xì)胞與腦動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(病變血管段數(shù)量：Spearman rho=-0.262, P=0.030;動(dòng)脈硬化狹窄度評(píng)分：Spearman rho=-0.248, P=0.040)此外,在調(diào)整可能的混雜因素影響后二者相關(guān)性仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而,動(dòng)脈粥樣硬化的負(fù)荷與FRS、另外兩個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞亞群之間相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.在校正年齡、吸煙、高血壓、收縮壓、纖維蛋白原和佛明漢評(píng)分后內(nèi)皮祖細(xì)胞各個(gè)亞型計(jì)數(shù)與腦動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)與顱外及混合腦動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而與顱內(nèi)動(dòng)脈硬化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二章骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的： EPCs作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,它具有向內(nèi)皮損傷部位分定向歸巢并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞及分泌內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等提高周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞功能,在維持血管內(nèi)皮完整性,修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)新生血管形成及組織修復(fù)等方面起重要作用,EPCs主要來(lái)源于骨髓、外周血,而骨髓中EPCs的含量是外周血的500倍。建立由C57BL/6小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化EPCs的培養(yǎng)體系。 方法： 選用4-6周齡的C57BL/6小鼠,PBS無(wú)菌條件下沖洗骨髓腔獲得細(xì)胞懸液。使用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法離心獲得骨髓單核細(xì)胞層,收集骨髓單核細(xì)胞,用PBS洗滌后接種于由人纖維連接蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)基選用EGM-2SingleQuots套裝,培養(yǎng)條件為37℃,5%C02。接種后第4天首次更換培養(yǎng)液,去除未貼壁細(xì)胞。此后,每?jī)商旄鼡Q一次細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)至第21天。 每日于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況,并拍攝照片。本研究選用培養(yǎng)至第21天的EPC進(jìn)行細(xì)胞鑒定。使用免疫熒光法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)EPC特異性表面抗原Sca-1及VEGFR2(CD309)'情況。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞雙表達(dá)Sca-1及VEGFR2比例。同時(shí),檢測(cè)細(xì)胞吞噬DiI標(biāo)記的乙�；兔芏戎鞍�(Dil-Ac-LDL)能力及結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的荊豆凝集素能力(FITC-UEA-1)。 結(jié)果： 首次換液后,貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)加速,漸出現(xiàn)細(xì)胞集落。集落形態(tài)為中央小圓形細(xì)胞聚集,周?chē)笮图?xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,我們還觀察到細(xì)胞可呈現(xiàn)線狀、管狀生長(zhǎng)排列,提示該細(xì)胞具有成血管能力。大約2周后的細(xì)胞形態(tài)趨于一致,呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長(zhǎng)狀態(tài)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也顯示,本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)至3周后的EPCs, CD34及VEGFR2雙陽(yáng)性率達(dá)到85%以上。培養(yǎng)細(xì)胞具備吞噬Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1的能力。 結(jié)論： 1.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究所采用密度梯度離心后貼壁篩選培養(yǎng)的方法可以從C57BL/6小鼠骨髓中成功分離培養(yǎng)EPCs。 2.在培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞呈“集落樣”生長(zhǎng)和“鋪路石”樣外觀,并可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)線、管狀排列生長(zhǎng)。且流式細(xì)胞檢查及細(xì)胞功能檢查均證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。為后續(xù)的脂聯(lián)素干預(yù)實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。 第三章脂聯(lián)素提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移活性及其機(jī)制探討 目的： 脂聯(lián)素是一種由白色脂肪組織分泌的分子量30kDa蛋白。脂聯(lián)素對(duì)血管保護(hù)的關(guān)鍵作用通過(guò)激活多種細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)途徑。例如增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的生成和清除氧自由基。循環(huán)血液中低脂聯(lián)素水平被認(rèn)為是一種新的冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,低脂聯(lián)素血癥將會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,同時(shí)具有內(nèi)皮細(xì)胞和祖細(xì)胞的一些生物學(xué)特性,EPCs是否也表達(dá)有脂聯(lián)素受體,脂聯(lián)素對(duì)EPCs的增殖和遷移功能有無(wú)影響及其具體的機(jī)制如何目前尚不清楚。 因此,我們提出假設(shè)：脂聯(lián)素可能會(huì)影響EPCs的數(shù)量和功能,增強(qiáng)損傷內(nèi)皮的修復(fù)能力,延緩動(dòng)脈硬化病變的發(fā)生和發(fā)展�；谠摷僭O(shè)我們擬采用第二部分成功建立的EPCs培養(yǎng)體系,初步探索脂聯(lián)素是否影響EPCs的增殖和遷移活性及其可能的作用機(jī)制。 方法： 1.先做EPCs的增殖曲線,自C57BL/6、鼠骨髓提取骨髓單核細(xì)胞,按照不同的濃度接種到培養(yǎng)板中,以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒行細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)不同接種濃度的EPCs的增殖活性； 2.進(jìn)一步探索不同劑量的脂聯(lián)素對(duì)EPCs增殖活性和遷移能力的影響情況,自C57BL/6小鼠骨髓提取骨髓單核細(xì)胞,計(jì)數(shù)后分為3組接種于培養(yǎng)板中。分別為：對(duì)照組、脂聯(lián)素處理組(培養(yǎng)液中脂聯(lián)素濃度分別為1和10ug/ml),以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒行細(xì)胞計(jì)數(shù)和Transwell做遷移能力測(cè)試；Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Akt、p-Akt、p-eNOS. eNOS表達(dá)情況； 3.自C57BL/6小鼠骨髓提取骨髓單核細(xì)胞,計(jì)數(shù)后分為6組接種于培養(yǎng)板中。分別為對(duì)照組、脂聯(lián)素(1ug/ml)組、NO供體組(sodium nitroprusside, SNP)、SNP+脂聯(lián)素(1ug/ml)組、eNOS抑制劑組(L-NAME)和L-NAME+脂聯(lián)素組。以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒行細(xì)胞計(jì)數(shù)了解各組細(xì)胞增殖能力；Transwell做遷移能力測(cè)試；Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白Akt、p-Akt、eNOS和p-eNOS表達(dá)情況；NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組上清液中NO的表達(dá)量。 4.提取小鼠骨髓單核細(xì)胞后誘導(dǎo)分化為EPCs,分為4組接種于培養(yǎng)板中。分別為對(duì)照組、脂聯(lián)素(1g/ml)組、LY294002組(Akt抑制劑)和LY294002+脂聯(lián)素(1ug/ml)組。以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒行細(xì)胞計(jì)數(shù)了解各組細(xì)胞增殖能力；Transwell做遷移能力測(cè)試；Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白Akt、p-Akt、eNOS和p-eNOS表達(dá)情況。 5.采用SPPS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示。多組間細(xì)胞增殖能力、遷移能力及NO、Akt、p-Akt、eNOS和p-eNOS等各指標(biāo)表達(dá)水平比較采用one-way ANOVA。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.不同接種濃度的單核細(xì)胞的增殖曲線 接種約5-11X105cells/cm2單核細(xì)胞,培養(yǎng)2周左右細(xì)胞達(dá)到增殖高峰期,因此,用該濃度的單核細(xì)胞接種2周后即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。 2.不同劑量的脂聯(lián)素對(duì)EPCs增殖活性和遷移能力的影響 脂聯(lián)素作用后EPCs的數(shù)量增加,該作用隨脂聯(lián)素劑量的增加而增強(qiáng),呈量效依賴性。脂聯(lián)素(1ug/ml)作用3天EPCs增殖活性和遷移能力既有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：Akt、p-Akt、p-eNOS、eNOS表達(dá)量脂聯(lián)素組較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3. eNOS抑制劑可以抑制脂聯(lián)素對(duì)EPCs的作用 p-eNOS表達(dá)量增高可提高脂聯(lián)素對(duì)EPCs的促增殖、遷移作用,但可被eNOS抑制劑L-NAME抑制。脂聯(lián)素作用3天后脂聯(lián)素組、SNP組、SNP+脂聯(lián)素(1ug/ml)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞遷移能力提高和上清液NO表達(dá)量增高；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：p-Akt、eNOS、p-eNOS表達(dá)量增高。L-NAME和L-NAME+脂聯(lián)素組則與上述結(jié)果相反,細(xì)胞增殖、遷移受到抑制,p-Akt、eNOS、p-eNOS、NO表達(dá)量較對(duì)照組并無(wú)增高。 4.磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002抑制脂聯(lián)素對(duì)EPCs的作用 脂聯(lián)素對(duì)EPCs的促增殖、抗凋亡作用與p-Akt、p-eNOS表達(dá)情況可被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002抑制。脂聯(lián)素作用3天后脂聯(lián)素(1ug/ml)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞遷移能力提高以及p-Akt、eNOS、 p-eNOS表達(dá)量增高,但與LY294002組和LY294002+脂聯(lián)素組比細(xì)胞數(shù)量降低、細(xì)胞遷移能力降低以及p-Akt、eNOS、p-eNOS表達(dá)量降低(P0.05)。 結(jié)論： 1.脂聯(lián)素促進(jìn)EPCs的增殖和遷移活性,該作用有一定的時(shí)間和劑量依賴性； 2.脂聯(lián)素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)了EPCs的增殖和遷移活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3

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