【摘要】：腦卒中(Strok e)是一種突然起病的腦部血液循環(huán)障礙性疾病,臨床上表現(xiàn)為一過(guò)性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征。缺血性卒中(ischemic stroke)占腦卒中病人總數(shù)的80-90%,是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,其致死率及致殘率高,給人民生活帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。缺血性卒中的發(fā)病危險(xiǎn)因素有很多種,包括糖尿病、肥胖、高血壓、血液黏度、心臟病等。既往有研究顯示血清尿酸(uricacid, UA)通常與導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化以及代謝紊亂的危險(xiǎn)因素同時(shí)存在,血清尿酸的升高與缺血性卒中的發(fā)病和死亡率相關(guān)。但是,有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了相反的研究結(jié)果,他們認(rèn)為缺血性卒中引起一連串級(jí)聯(lián)的代謝事件,產(chǎn)生大量的自由基,從而導(dǎo)致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷,而尿酸具有清除自由基作用,對(duì)缺血性卒中起到保護(hù)作用。并且,國(guó)外有學(xué)者通過(guò)大規(guī)模的臨床研究,結(jié)果也表明尿酸升高是缺血性卒中預(yù)后良好的保護(hù)因素�？梢�,目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)尿酸和缺血性卒中預(yù)后的相關(guān)性研究結(jié)果報(bào)道不一。而且,多高的尿酸水平才有利于患者的預(yù)后?目前國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。缺血性腦卒中的發(fā)病具有異源性,根據(jù)Org10172急性卒中治療試驗(yàn)(The Trial of Org10172 in Acute Stroke Treatment, TOAST)標(biāo)準(zhǔn),可分為大動(dòng)脈粥樣硬化型(Large-artery atherosclerosis,LAA)、小動(dòng)脈閉塞型(Small-artery occlusion lacunar, SAA)、心源性腦栓塞型(Cardioembolism, CE)、其他明確病因型(Stroke of other demonstrated etiology, SOE)和不明病因型(Stroke of other undemonstrated etiology, SUE)5種。各種類型缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和預(yù)后均有不同。LAA和SAA型卒中是缺血性卒中的主要病因,且兩者從本質(zhì)上來(lái)講與血管壁動(dòng)脈硬化相關(guān),可合并為非心源性缺血性卒中(non-cardioembolic ischemic stroke, NCIS)。缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病,確定在人群中普遍存在的可以干預(yù)的因素,并加以干預(yù)對(duì)預(yù)防和治療缺血性卒中至關(guān)重要,而血清尿酸可能就是這樣一種因素。我們擬對(duì)非心源性缺血性卒中與血清尿酸的關(guān)系進(jìn)行研究,探討急性期尿酸與患者的入院病情、卒中進(jìn)展、腦梗死體積和預(yù)后是否相關(guān),并進(jìn)一步探討多高的尿酸水平才有利于患者的預(yù)后。在研究中采用缺血性卒中病因分型,針對(duì)非心源性缺血性卒中進(jìn)行研究,一方面因?yàn)槊糠N型別卒中的樣本量減少,會(huì)使統(tǒng)計(jì)學(xué)把握度下降;但另一方面,亞型分析基于特定的病理生理機(jī)制,會(huì)增加所研究性狀的同質(zhì)性。權(quán)衡利弊,采用分型的策略更有利于探討尿酸與缺血性卒中的相關(guān)性。隨著分子生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究的進(jìn)展,人們認(rèn)識(shí)到腦血管疾病的發(fā)病、病理生理過(guò)程均與一些基因的表達(dá)和調(diào)控有著密切的關(guān)系。因此,從分子和基因水平對(duì)缺血性卒中進(jìn)行研究,探討通過(guò)基因的調(diào)控來(lái)預(yù)防和治療這類疾病已經(jīng)成為腦血管疾病研究的熱點(diǎn)之一。缺血性卒中的遺傳因素研究,不僅可以提供尋找缺血性卒中病因的線索,還可以為缺血性卒中的預(yù)防、診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。盡管目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)尿酸在缺血性卒中發(fā)病和預(yù)后中的作用存在爭(zhēng)議,但是尿酸猶如其他已確定或提出的卒中危險(xiǎn)因素一樣,參與了缺血性卒中的發(fā)生、發(fā)展以及治療和預(yù)后的全過(guò)程,這個(gè)觀點(diǎn)已得到愈來(lái)愈多的學(xué)者認(rèn)可。而目前,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-9(Facilitated Glucose Transporter 9, GLUT-9)基因多態(tài)性對(duì)血清尿酸水平的影響也漸成共識(shí)。GLUT-9基因位于4p15.3-p16,全長(zhǎng)214 025 bp,含1個(gè)非編碼區(qū)外顯子和13個(gè)編碼區(qū)外顯子,編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9(glucose transporter9, GLUT9),參與葡萄糖、果糖和尿酸等的代謝,在動(dòng)脈硬化的發(fā)病中起著重要作用。既往研究證實(shí)GLUT-9基因突變可導(dǎo)致基因功能缺失,從而導(dǎo)致腎臟失去重吸收尿酸能力,引起低尿酸血癥。在對(duì)多個(gè)國(guó)家的白種人群運(yùn)用基因芯片進(jìn)行全基因組掃描分析中,發(fā)現(xiàn)GLUT-9基因的遺傳變異與血清尿酸水平相關(guān)。這種相關(guān)性映射于非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn),定位于基因的5'-非翻譯區(qū)附近和內(nèi)含子3-7內(nèi)。目前,已有GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP與高尿酸血癥、痛風(fēng)、糖尿病和冠心病的相關(guān)性研究,尚未見對(duì)GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP與缺血性卒中的相關(guān)性研究。為進(jìn)一步探索GLUT-9基因多態(tài)性與血清尿酸和缺血性卒中的關(guān)系,本研究采用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)GLUT-9基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。檢測(cè)非心源性缺血性卒中患者GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn),并對(duì)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析,希望發(fā)現(xiàn)GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)基因型變異與缺血性卒中患者血清尿酸水平和臨床表型特征的關(guān)系,為今后深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。第一部分血清尿酸水平與非心源性缺血性卒中的相關(guān)性研究一研究對(duì)象和方法本研究對(duì)象均來(lái)源于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2011年1月至2014年4月連續(xù)登記在庫(kù)的缺血性卒中患者。非心源性缺血性卒中入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)按Kidwell分類診斷為“肯定腦卒中患者”；(2)根據(jù)缺血性腦卒中TOAST分類標(biāo)準(zhǔn)診斷為L(zhǎng)AA和SAA型腦卒中。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血、腦腫瘤、腦外傷；(2)有嚴(yán)重腎臟和肝臟疾病；(3)自身免疫性疾病史以及白血病、多發(fā)性骨髓瘤等明確腫瘤病史。進(jìn)展性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病后1周內(nèi),神經(jīng)缺損癥狀及體征進(jìn)行性加重；國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS)評(píng)分增加2分以上,并排除繼發(fā)性腦出血。收集的臨床資料包括年齡、性別、高血壓病、糖尿病、血脂異常、缺血性心臟病、短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack, TIA)、卒中史、吸煙、飲酒和家族史。采用尿酸酶—過(guò)氧化物酶法檢測(cè)患者血清尿酸。收集頭顱MR、DSA、心臟彩超、頸動(dòng)脈超聲等特殊檢查結(jié)果,對(duì)患者進(jìn)行TOAST分型。使用開放源圖像處理軟件OsiriX計(jì)算獲得急性腦梗死灶體積。收集患者入院NIHSS評(píng)分和出院改良Rankin量表(modified Rankin scale, mRS)評(píng)分,根據(jù)出院時(shí)mRS評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行分組。mRS評(píng)分0-2分為預(yù)后良好(預(yù)后良好組),mRS評(píng)分3-6分為頂后不良(預(yù)后不良組)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,各分析資料缺失率較小,通過(guò)個(gè)案刪除法將存在缺失值的個(gè)案刪除。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(方差齊)或t’(方差不齊)檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)(Median, M)和四分位數(shù)間距(Inter quartile range, IQR)表示,組間比較采用兩組或多組秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)、百分?jǐn)?shù)(%)表示,四格表資料采用四格表卡方檢驗(yàn)或四格表Fisher's exact檢驗(yàn),多個(gè)樣本率間的比較采用R×C無(wú)序列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)或者RxC無(wú)序列聯(lián)表Fisher's exact檢驗(yàn)。通過(guò)單因素和多因素Logistic回歸分析評(píng)價(jià)影響患者預(yù)后的因素。按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)分析組間各指標(biāo)之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二結(jié)果1.研究對(duì)象的一般臨床特點(diǎn)：連續(xù)收集我院2012年1月至2014年4月就診的LAA和SAA型缺血性卒中患者為研究對(duì)象(合并為非心源性缺血性卒中),共收集資料完整的非心源性缺血性卒中患者516例,平均年齡(66.252±12.850)歲,男性308例(59.7%),女性208例(40.3%)。患者的尿酸水平為336.5(131.8) μmol/L,最高尿酸水平為658μmol/L,最低尿酸水平為103μmol/L。非心源性缺血性卒中人群血清尿酸頻數(shù)分布呈正偏態(tài)分布。其中LAA型缺血性卒中157例(30.4%)、SAA型缺血性卒中359例(69.6%)。2.不同血清尿酸水平非心源性缺血性卒中患者的臨床特征比較為進(jìn)一步分析血清尿酸與非心源性缺血性卒中病情嚴(yán)重程度、進(jìn)展卒中和預(yù)后等臨床特征的關(guān)系,按血清尿酸濃度的20%、40%、60%和80%百分位數(shù)將患者分為5組進(jìn)行比較,這四個(gè)百分位數(shù)截取點(diǎn)分別為259、310、366和425μmol/L。分析發(fā)現(xiàn),五組間年齡、TOAST分型、NIHSS≥12分和進(jìn)展卒中比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而第一分位數(shù)組(≤259 μ mol/L)男性比例最低,預(yù)后不良發(fā)生率最高,與其它四組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p0.05)。3.不同血清尿酸水平患者腦梗死體積比較入院尿酸≤259μmol/L和259μmol/L組的腦梗死體積分別為[中位數(shù)(四分位間距)][1.512(7.894)]cm3和[1.018(3.363)]cm3.與入院尿酸259μmol/L組比較,≤259gmol/L組腦梗死體積較大,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.032,p=0.042)。4.急性期血清尿酸對(duì)患者預(yù)后判別能力的分析根據(jù)出院時(shí)所評(píng)定mRS評(píng)分將患者分為預(yù)后良好組(mRS評(píng)分≤2分)和預(yù)后不良組(mRS評(píng)分3分)。預(yù)后良好組342例(66.3%),預(yù)后不良組174例(33.7%)。以轉(zhuǎn)歸不良作為因變量進(jìn)行單因素logistic回歸分析,結(jié)果顯示：高齡(優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR):1.028,95%可信區(qū)間(confidence interval, CI):1.013～1.043；p0.001).既往卒中(OR:2.112,95％CI:1.349～3.304: p=0.001).NIHSS≥12分(OR:24.497,95％CI:7.370～81.419；p=0.001)和入院尿酸≤259 μ mol/L(OR:2.091,95％CI:1.346～3.246；p=0.001)是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。采用向前逐步法對(duì)上述各項(xiàng)臨床指標(biāo)進(jìn)行多因素logistic回歸分析,按照患者獲得不良預(yù)后的概率來(lái)擬合回歸模型,探討哪些指標(biāo)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示：高齡(OR:1.029,95％CI:1.012～1.046:p=0.001)、既往卒中(OR:1.796,95％CI:1.097～2.942；p=0.020).NIHSS ≥12分(OR:24.485,95％CI:7.168～83.634；p0.001)和入院血清尿酸≤259u mol/L(OR:2.069,95％CI:1.282～3.338；p=0.003)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。三結(jié)論1.急性期血清尿酸是急性缺血性卒中的一種消耗性抗氧化劑,其血清水平與腦梗死體積相關(guān),可作為早期評(píng)估非心源性缺血性卒中影像學(xué)病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。2. UA≤259 μmol/L是短期預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。急性期較低血清尿酸水平可能不利于非心源性缺血性卒中患者的短期預(yù)后,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。3.入院血清尿酸水平與入院病情嚴(yán)重程度和進(jìn)展卒中沒有相關(guān)性。第二部分GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與非心源性缺血性卒中的相關(guān)性研究一研究對(duì)象和方法本研究對(duì)象均來(lái)源于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2012年1月至2014年4月連續(xù)登記在庫(kù)的缺血性卒中患者。非心源性缺血性卒中入選標(biāo)準(zhǔn)為：(1)按Kidwell分類診斷為“肯定腦卒中患者”;(2)根據(jù)缺血性腦卒中TOAST分類標(biāo)準(zhǔn)診斷為L(zhǎng)AA和SAA型腦卒中。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血、腦腫瘤、腦外傷：(2)有嚴(yán)重腎臟和肝臟疾病；(3)自身免疫性疾病史以及白血病、多發(fā)性骨髓瘤等明確腫瘤病史。根據(jù)出院時(shí)所評(píng)定mRS評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行分組,mRS評(píng)分0-2分為預(yù)后良好(預(yù)后良好組),mRS評(píng)分3-6分為預(yù)后不良(預(yù)后不良組)。所有患者均對(duì)本研究知情同意,并簽署知情同意書。采用尿酸酶—過(guò)氧化物酶法檢測(cè)患者血清尿酸。抽提患者外周血I)NA, PCR擴(kuò)增GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)片段,然后通過(guò)DNA測(cè)序,篩查獲得GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP。利用在線分析軟件BDGP:Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)對(duì)GLUT-9基因5'-非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列中可能的核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線分析軟件TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)預(yù)測(cè)GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP鄰近序列(上、下游各10個(gè)堿基)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),最低可信值(q)設(shè)為0.85。Hardy-Weinberg檢驗(yàn)表明各SNP位點(diǎn)已達(dá)遺傳平衡,確認(rèn)所選樣本具有群體代表性。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),血清尿酸水平和腦梗死體積為非正態(tài)分布計(jì)量資料,用中位數(shù)(Median, M)和四分位數(shù)間距(Inter quartile range, IQR)表示,不同基因型組間尿酸水平和腦梗死體積比較采用秩和檢驗(yàn)。非心源性缺血性卒中患者預(yù)后良好組和預(yù)后不良組基因型分布用計(jì)數(shù)資料表示,組間比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)或者Fisher's exact檢驗(yàn),按a=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)分析組間各指標(biāo)之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二結(jié)果1.非心源性缺血性卒中患者GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)篩查結(jié)果共對(duì)86例非心源性缺血性卒中患者進(jìn)行了GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)的基因篩查。將GLUT-9基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約2 kb序列(-2030～+200)分成4個(gè)片段,依次命名為P1-P4。以患者外周血基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到各目的片段,對(duì)目的片段進(jìn)行直接測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析。共篩查到11個(gè)SNP,命名為SNP1-SNP11,這些SNP位于-2030～-88區(qū)域,大部分集中在第一外顯子附近。對(duì)86例非心源性缺血性卒中患者SNP1-SNP11基因分型結(jié)果與期望值進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè),p0.05,說(shuō)明觀察值與期望值無(wú)顯著性差異,與Hardy-Weinberg法則相符,有統(tǒng)計(jì)價(jià)值。2. GLUT-9基因核心啟動(dòng)子區(qū)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果利用在線分析軟件BDGP:Neural Network Promoter Prediction對(duì)GLUT-9基因5'-非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約2 kb序列進(jìn)行核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示該序列存在核心啟動(dòng)子,可能的位置在反義鏈的-550到-503區(qū)。采用TFSEARCH在線分析工具預(yù)測(cè)了含SNP1-SNP11不同等位基因在內(nèi)的鄰近序列上潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),預(yù)測(cè)結(jié)果表明,GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)的11個(gè)SNP位點(diǎn)鄰近序列存在與SRY、HSF、SP1、deltaE和cap等重要轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的位點(diǎn)。部分SNP變異可造成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)明顯變化。其中,含SNP1、2、3、4、5、6、9、10野生型和變異型等位基因序列存在不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；含SNP7、8不同等位基因序列均不存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：而SNP11不同等位基因的同一序列存在相同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。3.GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP與非心源性缺血性卒中患者血清尿酸水平、腦梗死體積和預(yù)后的相關(guān)性為了檢驗(yàn)次要變異基因影響血清尿酸水平和腦梗死體積的可能性,我們將具有變異等位基因雜合子和純合子的對(duì)象進(jìn)行合并,比較其與具有野生等位基因純合子對(duì)象的血清尿酸水平和腦梗死體積。結(jié)果顯示,各不同基因型間血清尿酸水平和腦梗死體積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。86例非心源性缺血性卒中患者中,預(yù)后良好63例,預(yù)后不良23例。對(duì)預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間11種SNP位點(diǎn)的基因型頻率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間11種SNP位點(diǎn)的基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。三結(jié)論1.GLUT-9基因5'-非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-550到-503區(qū)存在潛在的核心啟動(dòng)子。2. GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)基因型變異導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失和新結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生,GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)基因型變異可能對(duì)GLUT-9基因表達(dá)調(diào)控有顯著影響。3. GLUT-9基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)基因型變異可能與非心源性缺血性卒中患者血清尿酸水平、腦梗死體積和預(yù)后無(wú)關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3
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本文編號(hào)：2217127