發(fā)布時間：2018-08-22 17:41

【摘要】：目的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)具有高致殘率和高死亡率的臨床特點。目前,SAH的神經(jīng)功能障礙尚缺乏行之有效的治療方法。觀察SAH早期免疫炎癥反應的變化,并應用新型免疫抑制劑芬戈莫德(Fingolimod)干預,探索SAH治療的新途徑。方法第一部分:于基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO)下載小鼠腦基底動脈基因芯片(GSE46696),使用微陣列分析假手術(shù)組(Sham組)和模型組(SAH組)樣本各3份的基因變化,應用Cytoscape軟件對差異表達基因進行功能分析、通路富集分析以及基因-基因互相作用分析。第二部分:假手術(shù)組(Sham組)和造模組(SAH組)小鼠各12只,分別于造模后1d、3d各選取6只小鼠應用流式細胞儀檢測腦組織自然殺傷細胞(NK)、CD4+和CD25+內(nèi)源性調(diào)節(jié)性T細胞(Treg),分別于造模后1d、3d各選取6只小鼠應用Western Blot檢測腦組織免疫炎性因子,根據(jù)本論文第一部分分析結(jié)果,對相對顯著的免疫炎性因子或炎癥通路IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4進行檢測。第三部分:本部分實驗分為假手術(shù)組(Sham組)、造模+生理鹽水安慰劑組(SAH+Saline組)、造模+芬戈莫德治療組(SAH+Fingolimod組),SAH+Fingolimod組于造模后2h、48h、72h分別給予Fingolimod(FTY720)腹腔注射,給藥濃度為0.1mg/m L(按體重計算每只小鼠給藥約200-230μg)。分別于3組中造模給藥后第1d、3d抽取小鼠6只,應用流式細胞儀檢測模型腦組織自然殺傷細胞(NK)、CD4+和CD25+內(nèi)源性調(diào)節(jié)性T細胞;分別于3組中造模給藥后第3d抽取小鼠6只,應用Western Blot檢測模型腦組織炎癥細胞因子或炎癥通路IL-1β、TNF-α、NK-κB、TLR4;分別于3組中造模給藥后第1d、3d、7d、14d抽取小鼠6只,檢測腦組織水含量;分別于3組中造模給藥后第1d、3d、7d、14d抽取小鼠6只,自鼠尾靜脈注入2%伊文藍(EB)溶液,檢測腦組織EB含量;分別于3組中造模給藥后第1d、3d、7d、10d、14d抽取小鼠6只,應用mNNS評分和Morris水迷宮實驗,進行小鼠神經(jīng)功能評估。結(jié)果第一部分:小鼠SAH模型腦基底動脈的基因芯片及免疫炎癥因子的功能分析,可以發(fā)現(xiàn)在SAH早期免疫炎癥反應有可能是導致預后不良的重要原因,其中IL-1β、TNF-α等炎癥因子和NF-κB、TLR4等炎癥通路的顯著變化有可能是SAH早期腦損傷(EBI)嚴重程度的敏感標志之一。第二部分:SAH造模后早期NK細胞/CD3+T細胞的百分比明顯增高,與Sham組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05);SAH組CD4+和Foxp3+T細胞與CD4+T細胞計數(shù)的比例,與Sham組比較,略有升高,差異無統(tǒng)計學意義(均P0.05);Western Blot檢測腦組織免疫炎性因子或通路IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4與β-action蛋白的比例明顯升高,與Sham組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。第三部分:SAH早期,SAH+Saline組和SAH+Fingolimod組NK細胞、CD3+T細胞計數(shù)高于Sham組,SAH+Fingolimod組低于SAH+Saline組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05);SAH+Fingolimod組CD4+和Foxp3+T細胞計數(shù)高于SAH+Saline組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05);SAH+Fingolimod組IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4表達均低于同時間點SAH組,SAH+Fingolimod組炎性因子或通路的蛋白表達與β-action蛋白的比例均低于同時間點SAH組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05);第3d、7d檢測SAH+Fingolimod組腦組織水含量明顯低于SAH+Saline組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05);第3d、7d檢測SAH+Fingolimod組腦組織EB含量明顯低于SAH+Saline組,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05);自第3d起SAH+Fingolimod組mNSS評分明顯低于SAH+Saline組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);應用Morris水迷宮評價,SAH+Fingolimod組認知功能改善情況明顯好于SAH+Saline組,獲得性訓練和對位性訓練指標比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論SAH后發(fā)生的EBI是多種途徑的病理生理變化,對腦組織的損傷非常嚴重,繼而出現(xiàn)的CVS更是加重了腦損傷的程度。免疫炎癥反應越來越得到關(guān)注與重視,直接影響預后,通過本實驗可以初步判定免疫炎癥變化是SAH早期腦損傷的重要因素,免疫細胞和炎癥因子在腦損傷及修復過程中發(fā)揮了重要的作用。這為進一步有針對性的研究和探索SAH早期治療的藥物和方式提供了方向。SAH后出現(xiàn)的免疫炎癥反應影響其預后,EBI階段是治療干預SAH繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵時間段。Fingolimod是一種新型的免疫抑制劑,能夠有效的調(diào)控免疫功能,降低NK細胞比例水平,升高Treg細胞水平,減輕炎癥損傷作用,有助于促進SAH后腦損傷修復,改善BBB通透性,改善SAH預后,這為今后SAH早期藥物調(diào)控治療開辟了新的途徑,為臨床POC研究實施做好基礎實驗準備,這必將帶來前所未有的臨床意義和社會效益。SAH早期發(fā)生的免疫炎癥反應是導致其不良預后的重要原因。新型免疫抑制劑Fingolimod通過調(diào)控NK細胞、Treg細胞水平和IL-1β、TNF-α、NF-κB和TLR4等炎癥因子或炎癥通路變化,干預SAH后EBI期間的病生理反應,緩解CVS的程度,改善SAH預后,為SAH早期藥物治療開辟了新的思路。
[Abstract]:Objective To investigate the clinical characteristics of spontaneous subarachnoid hemorrhage (SAH) with high morbidity and mortality. At present, there is no effective treatment for SAH neurological dysfunction. To observe the changes of early immune inflammation reaction in SAH, and to explore a new way to treat SAH with Fingolimod. Part I: Download mouse basilar artery gene chip (GSE46696) from gene expression database (GEO), analyze the gene changes of sham operation group (Sham group) and model group (SAH group) by microarray, analyze the function of differentially expressed genes, pathway enrichment analysis and gene-gene interaction analysis by Cytoscape software. The second part: 12 mice in sham operation group (Sham group) and 12 mice in SAH group (SAH group), 6 mice in sham operation group (Sham group) and 6 mice in sham operation group (SAH group) were selected to detect the natural killer cells (NK), CD4 + and CD25 + endogenous regulatory T cells (Treg) by flow cytometry on the 1st and 3rd day after modeling, respectively. Six mice in sham operation group (Sham group) and 6 mice in SAH group (SAH group) were selected to detect the brain tissue immunity by Western Blot. Sexual factors, according to the results of the first part of this paper, the relatively significant immunoinflammatory factors or inflammatory pathways IL-1beta, TNF-a, NF-kappa B and TLR4 were detected. Part III: This part of the experiment was divided into sham operation group (Sham group), model + saline placebo group (SAH + Saline group), model + Fengolimod treatment group (SAH + Fingolimod group), SAH + Fingolimod group (SAH + Fingolimod group), SAH + Fingolimod group. The golimod group was injected intraperitoneally with Fingolimod (FTY720) 2 hours, 48 hours and 72 hours after modeling, and the concentration was 0.1 mg/ml (about 200-230 UG per mouse according to body weight). Six mice were selected from the three groups on the 1st and 3rd days after modeling. The endogenous regulatory activity of NK, CD4 + and CD25 + in the brain tissue of the model mice was detected by flow cytometry. T cells were extracted from 6 mice in 3 groups on the 3rd day after modeling administration, and inflammatory cytokines or inflammatory pathways IL-1beta, TNF-alpha, NK-kappa B and TLR4 were detected by Western Blot. Six mice in 3 groups were extracted on the 1st, 3rd, 7th and 14th day after modeling administration, respectively, and the water content in brain tissue was detected. Six mice were injected with 2% Evans blue (EB) solution from the tail vein to detect the content of EB in brain tissue. Six mice were selected from the three groups on the 1st, 3rd, 7th, 10th and 14th day after the injection. The neurological function of the mice was evaluated by mNNS score and Morris water maze test. Functional analysis of these subunits revealed that early immune inflammation may be an important cause of poor prognosis in SAH. Significant changes in inflammatory factors such as IL-1beta, TNF-alpha, and inflammatory pathways such as NF-kappa B and TLR4 may be one of the sensitive markers of the severity of early brain injury (EBI) in SAH. Part II: Early NK cells / CD3 + T after SAH modeling. The percentage of CD4 + and Foxp3 + T cells in SAH group was slightly higher than that in Sham group (all P 0.05). The percentage of CD4 + and Foxp3 + T cells in SAH group was slightly higher than that in Sham group (all P 0.05). There was no significant difference between Western Blot and Sham group in the detection of inflammatory factors or pathways of IL-1 beta, TNF-a, NF-kappa B and TLR4 and beta-actio. Compared with Sham group, the proportion of N protein increased significantly (all P 0.05). Part III: In early SAH, the number of NK cells, CD3 + T cells in SAH + Saline group and SAH + Fingolimod group was higher than Sham group, and the number of CD4 + and Foxp3 + T cells in SAH + Fingolimod group was lower than that in SAH + Saline group (all P 0.05). The expression of IL-1 beta, TNF-a, NF-kappa B and TLR4 in SAH + Fingolimod group was lower than that in SAH + Saline group (all P 0.05), and the expression of inflammatory factors or pathway protein and the ratio of beta-action protein in SAH + Fingolimod group were lower than that in SAH group at the same time point (all P 0.05). The brain water content of SAH + Fingolimod group was significantly lower than that of SAH + Saline group (all P 0.05), and the brain EB content of SAH + Fingolimod group was significantly lower than that of SAH + Saline group on the 3rd and 7th day (all P 0.05), and the mNSS score of SAH + Fingolimod group was significantly lower than that of SAH + Saline group (all P 0.05). Morris water maze test showed that the cognitive function of SAH + Fingolimod group was better than that of SAH + Saline group, and there was significant difference in the indexes of acquired training and contraposition training (P 0.05). Immunoinflammation has attracted more and more attention and has a direct impact on the prognosis. Through this experiment, we can preliminarily determine that immunoinflammation is an important factor of early brain injury in SAH. Immune cells and inflammatory factors play an important role in the process of brain injury and repair. Fingolimod is a new immunosuppressive agent, which can effectively regulate immune function, reduce the proportion of NK cells, and increase Treg cell level. Alleviating inflammation injury is helpful to promote the repair of brain injury after SAH, improve the permeability of BBB, and improve the prognosis of SAH. It opens up a new way for the early drug regulation and treatment of SAH in the future, and provides basic experimental preparation for the implementation of clinical POC research, which will certainly bring unprecedented clinical significance and social benefits. Fingolimod, a new immunosuppressive agent, intervenes in the pathophysiological response of EBI after SAH, alleviates CVS and improves the prognosis of SAH by regulating the levels of NK cells, Treg cells, IL-1beta, TNF-a, NF-kappa B and TLR4.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743.35

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本文編號：2197839