【摘要】：背景:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是世界上第二常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。研究發(fā)現(xiàn),PD的發(fā)生與年齡密切相關(guān),發(fā)病率在65歲以上老年人為1.7%,70歲以上老年人達到了3-5%。目前PD的臨床診斷主要是根據(jù)病史、臨床癥狀和體征及患者對多巴胺能藥物的治療反應。但因PD在疾病早期癥狀不典型,首發(fā)癥狀常為震顫、運動遲緩或肌強直,而這些臨床癥狀出現(xiàn)時,事實上多巴胺能神經(jīng)元變性缺失了50%-70%,這往往使患者錯失了早期診斷、早期治療的機會。且早期易與多系統(tǒng)萎縮、進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性和路易體癡呆等疾病相混淆,誤診率較高。文獻報道,PD的臨床與病理診斷符合率僅為76%左右。因此探討尋找一種有助于提氋早期PD臨床診斷的正確率、且無侵入性和創(chuàng)傷性的生物標志物,對于早期有效治療PD以及延緩疾病的進展,都具有非常重要的意義。近年來,PD生物標志物的研究主要集中在腦脊液和血漿/血清,但腦脊液的獲取需行腰椎穿刺,有創(chuàng),病人不易接受,使用受限。血漿/血清由于取樣快速、簡單、成本低和微創(chuàng),適合作為生物標志物的來源。目前來源于血漿/血清的PD生物標志物主要是關(guān)于DJ-1、α-突觸核蛋白和miRNA,但DJ-1、α-突觸核蛋白的表達水平不同研究的結(jié)果間存在差異,甚至相互矛盾;并且其濃度與PD的嚴重程度無相關(guān)性。近十年研究發(fā)現(xiàn)miRNA敏感度和特異度較高,并且部分miRNA的表達水平與PD的嚴重程度相關(guān),適合作為PD的生物標志物進行研究。microRNA(miRNA)是一種小的由21-24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)在人血清中存在各種miRNAs,且這種表達譜在機體的不同狀態(tài)時呈現(xiàn)特定的變化。已有研究表明,與正常對照健康人相比,帕金森病人的血漿/血清中miRNAs表達譜明顯不同。但是不同的研究得出的結(jié)果也有所不同,且穩(wěn)定性和重復性均不足。推測除了采用的方法不同、研究對象不同、驗證的樣本數(shù)量不同外,更重要的是以下兩方面的影響:1、血液中成分復雜,獲取的miRNA種類與表達水平變化較快,干擾結(jié)果的穩(wěn)定性;2、由于血腦屏障的存在,血液與大腦缺少直接的聯(lián)系。直接用血液的檢測結(jié)果不能客觀真實的反映顱內(nèi)疾病的狀態(tài)。目前研究顯示,mirna在體外主要有三種穩(wěn)定存在的形式:1、與高密度脂蛋白結(jié)合,但這種情況具有高度細胞特異性,主要是存在于肝細胞中;2、與ago2蛋白結(jié)合,但這種形式尚無令人信服的研究證明其可介導功能mirna的轉(zhuǎn)運,3、包裹于外泌體等膜囊泡中,這是近年研究的熱點。外泌體是一種膜性小囊泡,直徑約30-100nm,可由多種細胞在生理和病理條件下分泌,并存在于多種體液中。它通過轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、dna、mrna和mirna等物質(zhì)發(fā)揮功能。最近研究表明,外泌體由于其體積小,可透過血腦屏障從中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至體循環(huán),并且外泌體由于具備雙膜結(jié)構(gòu)能抵抗血液中核糖核酸酶的攻擊,mirna不易降解,穩(wěn)定性高。這提示血漿中外泌體所攜帶的mirna可能更真實地反映顱內(nèi)情況,具備作為帕金森病早期診斷生物標志物的潛力。目的:篩選出pd患者血漿外泌體中特異的mirna表達譜,并進行靶基因預測及kegg通路分析,qrt-pcr驗證,評價其對pd診斷的價值。方法:1、收集了51例散發(fā)性pd患者血漿和50例年齡/性別匹配的健康人血漿;2、用invitrogen試劑盒從血漿中分離外泌體,通過掃描電鏡觀察外泌體形態(tài)、qnano測定濃度及大小分布,westernblot檢測外泌體標記蛋白cd63、alix的表達以對其進行鑒定;3、使用高通道測序檢測兩組血漿外泌體mirna的表達差異。4、使用mirna靶基因預測軟件對差異表達的mirna進行靶基因預測,并對預測的靶基因進行kegg通路分析。5、采用使用taqman做探針的qrt-pcr技術(shù)驗證初篩得到的12種差異顯著的mirnas。結(jié)果:1、從血漿中分離得到mode直徑100nm、電鏡下表現(xiàn)為由脂質(zhì)雙分子層包裹的圓形或杯口狀囊泡、表達外泌體特異性標記蛋白cd63和alix的粒子,鑒定為外泌體。2、與對照組miRNA相比,PD組有66個miRNA表達明顯差異(Ratio2.0,P0.05),其中27個表達上調(diào),39個表達下調(diào)。3、預測到的與PD相關(guān)靶基因參與了ECM相互作用受體信號通路、神經(jīng)因子營養(yǎng)通路、VEGF信號通路、TGF轉(zhuǎn)化因子信號通路、白細胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移信號通路等信號通路。4、對初篩的表達差異顯著的12種miRNAs進一步運用qRT-PCR技術(shù)驗證。驗證后發(fā)現(xiàn)有6種miRNAs(hsa-miR-195、hsa-miR-302e、hsa-mi R-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p)在患者血漿外泌體中的表達與健康人血漿外泌體相比有顯著差異;hsa-mi R-195、hsa-miR-302e顯著上調(diào),而hsa-miR-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p顯著下調(diào)。結(jié)論:1、本研究成功分離并鑒定了血漿外泌體。2、PD患者血漿外泌體中miRNA表達譜與正常人具有顯著差異;我們發(fā)現(xiàn)PD患者血漿外泌體中mi RNA hsa-miR-195、hsa-mi R-302e顯著上調(diào),而hsa-miR-15b hsa-miR-485-5p、hsa-miR-4483、hsa-miR-493-3p顯著下調(diào);這6種miRNAs組合可能作為潛在的生物標志物進行PD診斷。
[Abstract]:BACKGROUND: Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in the world. It has been found that the incidence of PD is closely related to age. The incidence of PD is 1.7% in the elderly over 65 years old and 3-5% in the elderly over 70 years old. But the first symptoms of PD are often tremor, bradykinesia or myotonia because of atypical symptoms in the early stage of the disease. When these symptoms occur, in fact, the degeneration of dopaminergic neurons is lost by 50% - 70%, which often makes the patient miss the opportunity of early diagnosis and treatment. The clinical and pathological diagnostic coincidence rate of PD is only about 76%. Therefore, to explore a biomarker which is helpful to the clinical diagnosis of early PD, and is non-invasive and traumatic, for the early effective treatment. In recent years, the research on biomarkers of PD is mainly focused on cerebrospinal fluid and plasma/serum, but the acquisition of cerebrospinal fluid requires lumbar puncture, which is invasive, difficult for patients to accept and limited to use. At present, the main PD biomarkers derived from plasma/serum are DJ-1, alpha-synuclein and microRNA, but the results of different studies on the expression levels of DJ-1, alpha-synuclein are different, even contradictory, and their concentrations are not correlated with the severity of PD. MicroRNA (microRNA) is a small, single-stranded, non-coding RNA consisting of 21-24 nucleotides. Various kinds of microNAs are found in human serum, and the expression profiles are specific in different states of the body. Previous studies have shown that the expression profiles of microRNAs in plasma/serum of Parkinson's disease patients are significantly different from those of normal controls. However, the results of different studies are different, and the stability and repeatability are insufficient. The following two aspects are needed: 1. The composition of blood is complex, the type and expression of microRNAs acquired change quickly, interfering with the stability of the results; 2. Because of the existence of blood-brain barrier, blood and brain lack of direct contact. There are three main stable forms of Na in vitro: 1. binding to high-density lipoprotein, but this condition is highly cell-specific and mainly exists in hepatocytes; 2. binding to ago2 protein, but there is no convincing evidence that this form can mediate the transport of functional mirna, 3. encapsulating in the membrane vesicles such as exosomes, which is The exosome is a membrane vesicle with a diameter of about 30-100 nm. It can be secreted by a variety of cells under physiological and pathological conditions and exists in a variety of body fluids. The central nervous system metastases to the systemic circulation, and the exosome has a bimembranous structure which can resist the attack of ribonuclease in the blood, so the miRNA is not easy to degrade and has high stability. Specific miRNA expression profiles in plasma exosomes of PD patients were selected and analyzed by target gene prediction, KEGG pathway analysis and qRT-PCR to evaluate their diagnostic value. Exosome morphology was observed by electron microscopy, the concentration and size distribution of qnano were measured, and the expression of exosome marker protein CD63 and Alix were detected by Western blot for identification. 3. the expression of miRNA in plasma exosome was detected by high channel sequencing. The predicted target genes were analyzed for KEGG pathway. 5. Twelve different miRNAs were identified by qRT-PCR using TaqMan probe. Results: 1. Model was isolated from plasma with a diameter of 100 nm. Under electron microscopy, the model showed round or cup-shaped vesicles encapsulated by lipid bilayer and expressed exosome-specific marker proteins CD63 and cd63. Alx particles were identified as exosomes. 2. Compared with the control group, 66 microRNAs were significantly different in PD group (Ratio 2.0, P 0.05). 27 of them were up-regulated and 39 were down-regulated. 3. The predicted PD-related target genes were involved in ECM receptor signaling pathway, neurotrophic pathway, VEGF signaling pathway, TGF transforming factor signaling pathway. Six kinds of microRNAs (hsa-microRNAs-195, hsa-microRNAs-302 e, hsa-mi R-15b hsa-microRNAs-485-5p, hsa-microRNAs-4483, hsa-microRNAs-493-3p) were found to be expressed in the plasma of the patients and in the blood of healthy subjects. Hsa-mi R-195, hsa-mi-mi-302e were significantly up-regulated, hsa-mi-r-195, hsa-mi-15b hsa-mi-485-5p, hsa-mi-4483, hsa-mi-mi-493-3p were significantly down-regulated. CONCLUSIONS: 1. Plasma exosomes were successfully isolated and identified. 2. The expression profiles of microRNA in plasma exosomes of PD patients were significantly different from those of normal controls. MiRNA hsa-Mi-195, hsa-mi R-302 E were significantly up-regulated in the exosome, while hsa-Mi-15b hsa-Mi-485-5p, hsa-Mi-4483, hsa-Mi-493-3p were significantly down-regulated; these six microRNAs combinations may serve as potential biomarkers for PD diagnosis.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5

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本文編號：2185969