【摘要】：腦中風(fēng)(Stroke)是現(xiàn)代社會(huì)成年人群中最為普遍的一類高致死、高致殘性疾病之一。缺血性腦中風(fēng)(Ischemic stroke)是臨床最為主要的腦中風(fēng)類型。血栓形成后堵塞血管引起腦血流量降低而使腦組織發(fā)生缺血缺氧、軟化甚至壞死,是導(dǎo)致缺血性腦中風(fēng)的主要原因。因此,溶栓治療以及減緩神經(jīng)損傷、加速神經(jīng)功能恢復(fù)是治療缺血性腦中風(fēng)的關(guān)鍵。目前雖然已有FDA批準(zhǔn)的溶栓藥物tPA(Tissue plasminogen activator)用于腦中風(fēng)治療,但tPA容易加重血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)損傷誘發(fā)腦出血,毒副作用大。而與溶栓治療相比,影響缺血性腦中風(fēng)患者神經(jīng)修復(fù)進(jìn)程的因素復(fù)雜,越來(lái)越多的證據(jù)表明,神經(jīng)炎癥在其中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)炎癥像是一把雙刃劍,一方面加重神經(jīng)元損傷,另一方面促進(jìn)組織修復(fù)和髓鞘再生。因此,如何保護(hù)血腦屏障、減少tPA毒副作用,配合溶栓治療;同時(shí),探討神經(jīng)炎癥形成機(jī)制、尋找干預(yù)神經(jīng)炎癥進(jìn)程新措施,將對(duì)缺血性腦中風(fēng)防治具有重要意義。本論文圍繞上述兩個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究。論文第一部分圍繞神經(jīng)炎癥重要參與者,腦內(nèi)居留巨噬細(xì)胞—小膠質(zhì)細(xì)胞,研究糖代謝重塑調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化,參與神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制;論文第二部分圍繞唯一被FDA批準(zhǔn)的溶栓藥物tPA,探討視黃酸(Retinoic acid,RA)調(diào)控血腦屏障完整性,減弱tPA誘發(fā)的腦出血綜合癥相關(guān)研究。第一部分糖代謝重塑影響小膠質(zhì)細(xì)胞極化參與缺血性腦中風(fēng)的作用及機(jī)制研究小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)居留巨噬細(xì)胞,在免疫監(jiān)視、吞噬、修剪突觸結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要功能。與外周巨噬細(xì)胞一樣,小膠質(zhì)細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性,不同刺激激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表型及功能多樣。近年研究較多的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型主要有兩種:促進(jìn)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典型活化(Classicalactivation,M1)和發(fā)揮抗炎作用的替代型活化(Alternative activation,M2)。雖然M1/M2不能全面反映巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的多樣性活化,但代表了小膠質(zhì)細(xì)胞活化的兩種極端表型及其介導(dǎo)的不同炎癥反應(yīng)。因此,為了研究小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的雙面性,本論文仍延用"classical M1-like"和"alternative M2-like"描述小膠質(zhì)細(xì)胞的兩種極化類型,分別代表促進(jìn)炎癥-組織損傷和抗炎-組織修復(fù)的兩種作用。神經(jīng)炎癥主要由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞及它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子等所導(dǎo)致的,是治療缺血性腦中風(fēng)發(fā)生以后短期和長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)鍵性決定因素。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)居留巨噬細(xì)胞,極化激活后直接參與神經(jīng)炎癥發(fā)生。揭示小膠質(zhì)細(xì)胞極化機(jī)制對(duì)于控制神經(jīng)炎癥及相關(guān)疾病防治具有重要意義。越來(lái)越多的證據(jù)表明,代謝重編程參與巨噬細(xì)胞極化。M1型巨噬細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵調(diào)控酶 PFKFB3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3)表達(dá)升高,糖酵解速率明顯增加;但是在M2型巨噬細(xì)胞中糖酵解被抑制,脂代謝(Fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化則明顯增強(qiáng)。葡萄糖被認(rèn)為是腦內(nèi)最主要的能量來(lái)源。已有研究表明,葡萄糖代謝重塑與小膠質(zhì)細(xì)胞極化密切相關(guān)。在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞系中,LPS/IFN-y通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glucose transport 1,GLUT1)表達(dá)、提高己糖激酶和乳酸脫氫酶活性來(lái)提升糖酵解速率。糖酵解終產(chǎn)物乳酸鹽不能長(zhǎng)期貯存在細(xì)胞內(nèi),主要經(jīng)乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體排除體外。在缺血性腦中風(fēng)大鼠模型中,乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT1(Monocarboxylate transporter 1)和MCT2在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)都顯著升高。然而MCTs及糖酵解過(guò)程在小膠質(zhì)細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)中的作用仍然沒(méi)有報(bào)道。綜上,本論文重點(diǎn)研究MCTs介導(dǎo)的乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)糖酵解在小膠質(zhì)細(xì)胞極化和缺血性腦中風(fēng)神經(jīng)炎癥中的作用。一、缺血再灌注小鼠腦內(nèi)"classical M1-l ike"型小膠質(zhì)細(xì)胞及其表達(dá)的MCT1、MCT2和MCT4顯著升高M(jìn)CAO(Middle cerebral artery occlusion)是一類常用的缺血性腦中風(fēng)模型,被廣泛用來(lái)研究缺血再灌注之后神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。因此,本課題首先利用MCAO模型來(lái)探究缺血再灌注之后參與神經(jīng)炎癥的小膠質(zhì)細(xì)胞極化類型以及糖酵解相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT的表達(dá)變化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠MCAO之后"classical" like小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物—Iba1和CD86的表達(dá)。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,小鼠缺血再灌注1天和3天后缺血區(qū)半暗帶區(qū)域Iba1+/CD86+雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,提示MCAO后小膠質(zhì)細(xì)胞向"classical" like型極化的數(shù)量增多。同時(shí)通過(guò)CD86和MCT1、MCT2或者M(jìn)CT4免疫雙熒光染色發(fā)現(xiàn),MCAO之后缺血區(qū)半暗帶部位"classical" like小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT1、MCT2和MCT4表達(dá)明顯升高。二、M1(LPS)型小膠質(zhì)細(xì)胞中乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT1、MCT4及糖酵解關(guān)鍵調(diào)控酶PFKFB3表達(dá)顯著升高1、LPS刺激顯著促進(jìn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系MCT1、MCT4和PFKFB3表達(dá)為探究MCTs及糖酵解與"classical M1-like"小膠質(zhì)細(xì)胞極化之間的關(guān)系,體外培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系后分別給予LPS和IL-4刺激,然后檢測(cè)BV2細(xì)胞中M1、M2標(biāo)志分子和糖酵解關(guān)鍵調(diào)控分子MCTs、PFKFB3的變化。RT-PCR結(jié)果顯示,LPS處理明顯促進(jìn)iNOS、IL-1β、IL-6和STAT1表達(dá);而IL-4刺激上調(diào)Arg1和CD206表達(dá)水平。同時(shí)檢測(cè)MCTs和PFKFB3的表達(dá)發(fā)現(xiàn),只有LPS刺激顯著上調(diào)MCT1、MCT4和PFKFB3的表達(dá)水平,IL-4刺激后無(wú)顯著變化。MCT2在LPS和IL-4刺激后雖然都有上升趨勢(shì),但與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。2、LPS刺激顯著促進(jìn)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞MCT1、MCT4和PFKFB3表達(dá)為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,原代分離新生小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞,LPS和IL-4分別刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS處理特異性地促進(jìn)MCT1、MCT4和PFKFB3的表達(dá),但I(xiàn)L-4處理后無(wú)明顯變化。上述結(jié)果顯示,在LPS誘導(dǎo)的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞中,糖酵解相關(guān)調(diào)節(jié)分子MCT1、MCT4和PFKFB3表達(dá)顯著升高,提示糖酵解與M1(LPS)型極化存在著密切的關(guān)系。三、MCT1以PFKFB3依賴方式促進(jìn)糖酵解,增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化1、干擾MCT1抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志分子的表達(dá)為研究MCTs能否決定小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化,分別設(shè)計(jì)MCT1、MCT2和MCT4的干擾慢病毒。BV2細(xì)胞感染慢病毒和LPS刺激后檢測(cè)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)。RT-PCR和Western b1ot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,干擾MCT1顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá),但干擾MCT2和干擾MCT4對(duì)LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)都無(wú)明顯作用。同時(shí),干擾MCT1顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和STAT1的表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)MCT1對(duì)于LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化是必不可少的。2、干擾MCT1抑制LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的糖酵解為進(jìn)一步評(píng)估MCT1調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化過(guò)程中糖酵解變化,利用乳酸鹽試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸鹽水平。結(jié)果顯示,LPS刺激BV2顯著促進(jìn)乳酸鹽釋放;干擾MCT1抑制上述過(guò)程。然而,干擾MCT2和干擾MCT4對(duì)于LPS誘導(dǎo)的乳酸鹽的釋放無(wú)顯著影響。同時(shí),干擾MCT1顯著降低糖酵解調(diào)控酶PFKFB3的表達(dá),但是干擾MCT2和干擾MCT4對(duì)PFKFB3的表達(dá)無(wú)作用。以上結(jié)果提示,MCT1通過(guò)促進(jìn)糖酵解速率來(lái)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。3、外源性乳酸鹽抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化為驗(yàn)證MCT1介導(dǎo)的乳酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)在小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化中的作用,外源加入乳酸鹽抑制BV2細(xì)胞中乳酸鹽向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果表明,乳酸鹽顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)。同時(shí)乳酸鹽也逆轉(zhuǎn)了 LPS介導(dǎo)的PFKFB3表達(dá)升高。上述結(jié)果證實(shí)MCT1通過(guò)促進(jìn)糖酵解過(guò)程參與LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。4、MCT1通過(guò)上調(diào)糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3表達(dá)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化為研究PFKFB3在MCT1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化中的作用,設(shè)計(jì)并構(gòu)建PFKFB3過(guò)表達(dá)慢病毒。MCT1干擾慢病毒和PFKFB3過(guò)表達(dá)慢病毒同時(shí)感染BV2細(xì)胞后在給予LPS刺激,收集細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)PFKFB3能夠逆轉(zhuǎn)干擾MCT1對(duì)iNOS,IL-1β、IL-6表達(dá)的抑制作用。然而,干擾MCT1和過(guò)表達(dá)PFKFB3對(duì)Arg1和CD206都無(wú)顯著影響。四、干擾MCT1抑制LPS介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞STAT1磷酸化文獻(xiàn)報(bào)道,STAT1參與小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞M1型極化以及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步確定MCT1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的作用,我們檢測(cè)了STAT1和p-STAT1的水平。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS刺激24小時(shí)后,干擾MCT1明顯抑制LPS誘導(dǎo)的STAT1表達(dá)。另外,LPS刺激條件下,過(guò)表達(dá)PFKFB3可以消除干擾MCT1對(duì)STAT1表達(dá)的抑制作用。文獻(xiàn)表明,LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞3小時(shí)即可以促使STAT1的磷酸化達(dá)到一個(gè)峰值。為探究MCT1對(duì)STAT1磷酸化的影響,檢測(cè)LPS刺激3小時(shí)后p-STAT1的水平。結(jié)果表明,LPS刺激3小時(shí)后,干擾MCT1顯著抑制LPS誘導(dǎo)的STAT1磷酸化。另外,過(guò)表達(dá)PFKFB3也明顯抑制干擾MCT1對(duì)p-STAT1的影響。上述結(jié)果表明MCT1調(diào)控的糖酵解過(guò)程可能是通過(guò)影響STAT1的磷酸化介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。五、MCT1通過(guò)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向"classical M1-l ike"極化加重糖氧剝奪介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷糖氧剝奪實(shí)驗(yàn)(Oxygen-glucose deprivation,OGD)是體外研究缺血再灌注過(guò)程的經(jīng)典模型。為研究MCT1介導(dǎo)的糖酵解促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞"classical M1-like"型極化后對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的影響,將小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2和神經(jīng)元細(xì)胞系SH-SY5Y共培養(yǎng)并經(jīng)歷糖氧剝奪實(shí)驗(yàn)。1、糖氧剝奪處理顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT1、MCT4和PFKFB3表達(dá)首先將培養(yǎng)的BV2進(jìn)行糖氧剝奪2小時(shí)處理,檢測(cè)BV2細(xì)胞中MCTs和PFKFB3等表達(dá)。結(jié)果顯示,糖氧剝奪之后M1型標(biāo)志分子iNOS、IL-1β、IL-6和STAT1表達(dá)顯著升高。同時(shí),糖氧剝奪顯著促進(jìn)MCT1、MCT4和PFKFB3表達(dá)。上述結(jié)果表明,糖氧剝奪促進(jìn)BV2細(xì)胞向"classical M1-like"型極化,并上調(diào)糖酵解相關(guān)分子MCT1、MCT4和PFKFB3的表達(dá)。2、干擾小膠質(zhì)細(xì)胞MCT1表達(dá)顯著抑制糖氧剝奪處理介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷利用Transwell來(lái)共培養(yǎng)BV2和SH-SY5Y。首先利用干擾慢病毒抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中MCT1表達(dá),然后將它們進(jìn)行糖氧剝奪處理。24小時(shí)后,采用MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞活性。結(jié)果顯示,糖氧剝奪明顯減弱SH-SY5Y的存活,干擾小膠質(zhì)細(xì)胞MCT1表達(dá)顯著抑制糖氧剝奪介導(dǎo)的SH-SY5Y的損傷。但是干擾MCT2卻無(wú)顯著作用。3、干擾小膠質(zhì)細(xì)胞MCT1表達(dá)顯著抑制炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放為探討干擾小膠質(zhì)細(xì)胞MCT1表達(dá)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)的影響,RT-PCR檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子IL-1β,IL-6和TNF-a的mRNA水平,以及ELISA檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放到胞外的炎癥因子的蛋白水平。結(jié)果表明,干擾MCT1明顯抑制糖氧剝奪促進(jìn)的IL-1β,IL-6和TNF-α的表達(dá)。第二部分視黃酸保護(hù)血腦屏障減緩tPA介導(dǎo)的腦出血在缺血性腦中風(fēng)中的作用及機(jī)制研究完整的血腦屏障(Blood-brainbarrier,BBB)是維持突觸和神經(jīng)元正常功能的微環(huán)境結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血腦屏障主要由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間連接復(fù)合體、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足和周細(xì)胞等組成。研究發(fā)現(xiàn),在缺血性腦中風(fēng)病人和動(dòng)物模型中都發(fā)現(xiàn)了明顯的血腦屏障損傷。究其原因,主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接復(fù)合體相關(guān)蛋白 VE-cadherin(vascular endothelial cadherin)、ZO-1(zonula occludens-1)、claudin-5、Occludin和PECAM-1等明顯降低改變了血腦屏障滲透性導(dǎo)致的。另外,研究報(bào)道稱FDA批準(zhǔn)使用的強(qiáng)效溶栓藥物tPA是造成血腦屏障損傷的充分必要條件。TPA 可以通過(guò)激活 PDGF-CC(platelet-derived growth factor-CC)與其受體PDGF-α結(jié)合,進(jìn)一步加重腦缺血病人中血腦屏障損傷,進(jìn)而導(dǎo)致腦出血發(fā)生。這一原因極大地限制了 tPA的使用范圍。因此,通過(guò)血腦屏障保護(hù)來(lái)減輕tPA介導(dǎo)的腦出血副作用是治療缺血性腦中風(fēng)的重要策略。視黃酸(Retinoic acid,RA)作為具有生物活性的維生素A的衍生物,在脊椎動(dòng)物早期器官發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有報(bào)道證明放射狀膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的視黃酸通過(guò)上調(diào)VE-cadherin,ZO-1和Occludin等血腦屏障相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)早期小鼠胚胎血腦屏障的發(fā)育形成。然而,視黃酸在缺血性腦中風(fēng)中血腦屏障損傷及tPA介導(dǎo)的腦出血綜合癥中的作用尚不清楚。本課題擬從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中共同探討視黃酸保護(hù)血腦屏障減緩tPA介導(dǎo)腦出血的作用機(jī)制。一、視黃酸預(yù)處理減輕MCAO大鼠血腦屏障損傷,并增加神經(jīng)保護(hù)作用1、視黃酸顯著提升血腦屏障相關(guān)蛋白ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)研究表明視黃酸通過(guò)調(diào)控血腦屏障相關(guān)蛋白參與小鼠早期胚胎血腦屏障的形成。為研究視黃酸對(duì)成年大鼠腦內(nèi)血腦屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控,大鼠腹腔連續(xù)四天注射不同劑量的視黃酸后從背外側(cè)皮層部位取材提取mRNA進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5mg/kg和25mg/kg濃度的視黃酸特異性增加ZO-1和VE-cadherin表達(dá)水平,但是對(duì)Claudin-5、Occludin和PECAM-1等表達(dá)沒(méi)有影響。2、視黃酸預(yù)處理顯著減弱MCAO導(dǎo)致的血腦屏障損傷為探究視黃酸預(yù)處理對(duì)于缺血性腦中風(fēng)導(dǎo)致的血腦屏障損傷的作用,選取MCAO作為缺血性腦中風(fēng)模型。SD大鼠MCAO后向頸靜脈內(nèi)注射伊文思藍(lán),結(jié)果發(fā)現(xiàn),視黃酸預(yù)處理明顯抑制缺血性腦中風(fēng)導(dǎo)致的伊文思藍(lán)向腦內(nèi)擴(kuò)散,這一結(jié)果證實(shí)視黃酸可以保護(hù)缺血性腦中風(fēng)中血腦屏障損傷。3、TTC染色實(shí)驗(yàn)證明視黃酸預(yù)處理減弱MCAO導(dǎo)致的腦梗死面積文獻(xiàn)表明,完整的血腦屏障可以減弱缺血性腦中風(fēng)中神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能學(xué)損傷。為探究視黃酸對(duì)血腦屏障的保護(hù)能否改善神經(jīng)損傷,大鼠MCAO后大腦進(jìn)行TTC染色。結(jié)果表明,視黃酸預(yù)處理顯著減小MCAO導(dǎo)致的梗死區(qū)域,以上結(jié)果提示視黃酸在缺血性腦中風(fēng)中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。4、視黃酸預(yù)處理減弱MCAO大鼠中溶血栓藥物tPA介導(dǎo)的血腦屏障損傷為進(jìn)一步研究視黃酸對(duì)tPA介導(dǎo)的血腦屏障損傷的影響,SD大鼠MCAO后進(jìn)行tPA注射。伊文思藍(lán)實(shí)驗(yàn)證明,與MCAO大鼠注射PBS組相比,tPA注射明顯增加腦內(nèi)伊文思藍(lán)水平。視黃酸預(yù)處理組注射tPA后顯著減少伊文思藍(lán)向腦內(nèi)擴(kuò)散。以上結(jié)果提示視黃酸預(yù)處理顯著減輕tPA導(dǎo)致的血腦屏障損傷。二、視黃酸預(yù)處理顯著抑制缺血性腦中風(fēng)大鼠ZO-1和VE-cadherin的降低ZO-1和VE-cadherin作為腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接蛋白復(fù)合體的重要組成成分,對(duì)BBB的完整性的維持起著非常重要的作用。為檢測(cè)視黃酸對(duì)MCAO后ZO-1和VE-cadherin表達(dá)的影響,利用免疫熒光和western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)它們的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,與假手術(shù)組相比,MCAO降低了 ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)。視黃酸預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)了 MCAO導(dǎo)致的ZO-1和VE-cadherin的降低,這一結(jié)果表明,視黃酸可能通過(guò)提升ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)對(duì)血腦屏障起到保護(hù)作用。三、視黃酸通過(guò)RARα受體上調(diào)ZO-1和VE-cadher i n表達(dá)并減弱血腦屏障滲透性1、抑制RARα受體顯著抑制視黃酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞滲透性及ZO-1和VE-cadherin表達(dá)的調(diào)控為探究視黃酸對(duì)血腦屏障保護(hù)作用的分子機(jī)制,選擇體外培養(yǎng)的大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系RBE4作為體外的血腦屏障模型。視黃酸配合使用RARα或RARβ受體抑制劑加入RBE4細(xì)胞,將RBE4進(jìn)行缺氧乏糖處理。經(jīng)檢測(cè)FITC-dextran的透過(guò)率來(lái)反應(yīng)血腦屏障滲透性。結(jié)果顯示,視黃酸降低了 FITC-dextran的透過(guò)率。RARα拮抗劑明顯破壞了視黃酸對(duì)FITC-dextran通透性的抑制作用,但是RARβ拮抗劑無(wú)顯著作用,以上結(jié)果表明,視黃酸通過(guò)RARα受體調(diào)控血腦屏障滲透性。同時(shí)檢測(cè)血腦屏障相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果表明,視黃酸處理上調(diào)ZO-1和VE-cadherin的表達(dá),但不影響Claudin-5的表達(dá)。RARα拮抗劑可以阻斷視黃酸對(duì)ZO-1和VE-cadherin的促進(jìn)效應(yīng)。但是RARβ拮抗劑對(duì)視黃酸調(diào)控的ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)沒(méi)有影響。2、RNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)視黃酸通過(guò)上調(diào)ZO-1和VE-cadherin來(lái)調(diào)控血腦屏障滲透性為探究視黃酸對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用與上調(diào)ZO-1和VE-cadherin表達(dá)之間的相關(guān)性,分別合成了兩者的siRNA寡聚核苷酸鏈。結(jié)果表明,干擾ZO-1和VE-cadherin都可以一定程度上減弱視黃酸對(duì)血腦屏障滲透性的調(diào)節(jié),提示著視黃酸通過(guò)調(diào)節(jié)ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮血腦屏障保護(hù)作用。綜上,本論文證實(shí)視黃酸通過(guò)RARα受體特異性上調(diào)血腦屏障相關(guān)蛋白ZO-1和VE-cadherin的表達(dá),進(jìn)而減弱缺血性腦中風(fēng)介導(dǎo)的血腦屏障損傷。四、視黃酸減弱MCAO大鼠中tPA介導(dǎo)的腦出血和神經(jīng)行為學(xué)損傷1、視黃酸治療減弱MCAO大鼠tPA注射導(dǎo)致的腦出血為研究視黃酸對(duì)tPA導(dǎo)致的腦出血的作用,采用文獻(xiàn)中一種常用的高糖加tPA介導(dǎo)腦出血?jiǎng)游锬Ｐ�。與PBS組相比,TPA注射后缺血側(cè)腦內(nèi)血紅蛋白的量明顯增加。MCAO后立即給予視黃酸治療顯著降低tPA導(dǎo)致的缺血側(cè)血紅蛋白水平,以上結(jié)果說(shuō)明,視黃酸配合tPA治療有效阻止了 tPA導(dǎo)致的腦出血副作用。2、視黃酸治療改善MCAO大鼠tPA介導(dǎo)的ZO-1和VE-cadherin的降低文獻(xiàn)表明,tPA通過(guò)破壞ZO-1、Claudin-5和VE-cadherin等連接蛋白加重血腦屏障損傷。為檢測(cè)視黃酸對(duì)tPA降低的ZO-1和VE-cadherin的影響,western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩者蛋白水平。結(jié)果表明,tPA明顯降低ZO-1和VE-cadherin的表達(dá),視黃酸顯著減輕tPA導(dǎo)致的ZO-1和VE-cadherin的降低。3、視黃酸處理改善MCAO大鼠tPA導(dǎo)致的神經(jīng)功能學(xué)損傷為探究缺血性腦中風(fēng)中視黃酸對(duì)tPA加重的神經(jīng)功能學(xué)損傷的影響,采用Neurological scores和Tape removal test兩種行為檢測(cè)模型。結(jié)果表明,tPA注射顯著加重神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和tape撕掉的時(shí)間,說(shuō)明tPA單獨(dú)治療加重神經(jīng)行為學(xué)損傷。視黃酸配合tPA治療后,動(dòng)物的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和tape撕掉的時(shí)間都顯著降低。以上結(jié)果提示,視黃酸在缺血性腦中風(fēng)中顯著改善tPA導(dǎo)致的神經(jīng)功能學(xué)損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3
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本文編號(hào)：2181370