【摘要】：研究背景：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)指腦底部或腦表面的病變血管破裂,血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征,具有較高的死亡率,致殘率,是一種非常嚴重及常見的疾病。12.4%的患者在送到醫(yī)院之前就已經(jīng)死亡,另外大約40%到50%的患者在發(fā)病后頭30天內(nèi)死亡。此外,在能夠生存下來的患者中,還有10%到20%的患者遭受嚴重的神經(jīng)功能障礙。SAH造成的腦損傷不僅給患者家庭帶來嚴重的情感傷害,還給社會和家庭帶來很重的經(jīng)濟負擔。雖然隨著近年來在動脈瘤腔內(nèi)血管技術(shù)、診斷方法、圍手術(shù)期處理及手術(shù)技巧等方面都有了明顯進步,但因SAH引起的致死致殘率仍無明顯改善。 SAH后復雜的病理過程以及其精確的調(diào)控機制至今仍然不完全清楚,目前認為,SAH發(fā)生后腦內(nèi)的變化包括：顱內(nèi)壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓降低、血腦屏障破壞、腦腫脹、腦水腫、嚴重的腦血管痙攣以及自身調(diào)節(jié)功能障礙等。SAH發(fā)病后72h內(nèi)發(fā)生的包括上述一系列的改變造成的直接損害,稱之為早期腦損傷(EBI)。在這期間顱內(nèi)的這些變化會引起許許多多的分子激活,包括炎癥介質(zhì)、細胞凋亡介質(zhì)以及內(nèi)源性保護因子等。SAH后顱內(nèi)的病理過程可以激活許多的內(nèi)源性保護因子,發(fā)揮腦保護作用。充分挖掘這些內(nèi)源性腦保護因子的潛力,特別是在神經(jīng)元中表達的保護因子,可能成為降低SAH引起的死殘率新的治療方向。 腦紅蛋白(Neuroglobin,Ngb),又叫神經(jīng)球蛋白,由德國科學家Burmester于2000年首次在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類新的球蛋白,以神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達為主。自Ngb被發(fā)現(xiàn)以來,很快掀起了一股研究熱潮,人們對其結(jié)構(gòu)、分子機制以及腦保護作用進行了大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)Ngb是一種含血紅色的單一亞基蛋白質(zhì),并且有21%的序列跟脊椎動物肌紅蛋白相似,25%的序列跟血紅蛋白相似。然而,跟肌紅蛋白和血紅蛋白不同的是,Ngb兩端并處于血紅素形成的袋狀結(jié)構(gòu)中組氨酸可以直接結(jié)合血紅素中的鐵離子(包括Fe2+和Fe3+),這是由于Ngb結(jié)構(gòu)上的特殊性導致的。目前關(guān)于Ngb的生物學功能尚未完全清楚,人們推測其功能可能與下面的幾個方面有關(guān)：①氧氣的儲存和缺氧時促進氧氣向線粒體或者直接介導氧氣向線粒體傳遞：因為Ngb結(jié)構(gòu)非常類似血紅蛋白和肌紅蛋白,以及它能夠結(jié)合氧氣；②氧感受功能和清除活性氧、N0基團等活性物質(zhì)：Ngb可能是作為氧感受器,根據(jù)氧濃度的變化參與細胞內(nèi)信號傳導通路調(diào)節(jié)；清除活性氧、NO基團等活性物質(zhì)：因為其能夠結(jié)合NO；③調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路。④保護線粒體功能：通過抑制GDP從Ga蛋白上分離以及促進Gp Y復合物的釋放,從而降低細胞色素c。 當前的研究雖然不能完全解析Ngb的功能,但是許多文獻的報道,其在動物、原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及細胞系中的神經(jīng)保護作用是得到支持的,特別是在缺血缺氧時Ngb的神經(jīng)保護作用。有實驗證明在大腦局灶性和半球的缺血的模型下,Ngb轉(zhuǎn)基因小鼠的缺血體積比正常老鼠的要小,并且氧化應(yīng)激相關(guān)指標的含量也降低。同樣的結(jié)果也在大鼠大腦中動脈閉塞模型中得到驗證,通過給予表達Ngb的腺病毒載體增加Ngb表達后,其梗塞面積大大減少,相反,通過腦室內(nèi)注射反義寡脫核苷酸序列減少Ngb的表達,發(fā)現(xiàn)梗塞面積增大,以及更嚴重的神經(jīng)功能損害。此外,在體外實驗部分,在培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞中,Ngb過表達的細胞降低缺血復氧損傷的敏感性。再者,越來越多的證據(jù)表明Ngb不僅僅在缺血缺氧腦損傷中有保護作用,在其他一些疾病中也有保護作用。例如,在神經(jīng)細胞和小鼠阿爾茲海默病模型中均證實,Ngb過度表達降低p-淀粉樣蛋白和NMDA的毒性,從而起到保護作用。 目前已經(jīng)有實驗證明Ngb在腦缺血及外傷性腦損傷后參與了調(diào)控并起一個保護作用。但是據(jù)我們所知,目前關(guān)于Ngb在SAH后腦組織的表達尚未有報道,基于此,我們設(shè)計了本項課題,通過建立大鼠SAH模型來研究Ngb的表達,并探討其潛在的作用機制。 目的： 本實驗中采用視交叉前池注血法建立大鼠SAH模型,應(yīng)用Western blot analysis、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)分別檢測顳葉皮質(zhì)Ngb蛋白水平及mRNA水平的變化,免疫組化法及免疫熒光雙染法觀察SAH后腦組織中Ngb的表達及細胞定位,總結(jié)Ngb在SAH后的不同時間含量變化及部位變化的規(guī)律,并探討Ngb在SAH后表達變化的意義及其潛在的作用機制。 方法： 1實驗動物和分組 取健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠84只,體重280～320g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。按隨機數(shù)字表法將實驗大鼠分為空白對照組12只和SAH組72只。SAH組根據(jù)動物模型建立后3、6、12、24、48、72小時6個時間點分為6個亞組,每個亞組12只大鼠,其中6只大鼠腦組織進行新鮮組織制備,用于Western blot analysis及實時定量PCR檢測,6只甲醛固定用于免疫組化染色及免疫熒光雙染。 2大鼠SAH模型的建立 采用視交叉前池注血法建立SAH模型。采用4%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射將大鼠麻醉后,取俯臥位,利用立體定向儀將大鼠頭部固定,并保持顱頂水平位。備皮及常規(guī)消毒后,沿顱頂正中矢狀線切開皮膚、肌肉及骨膜,于前囟前7.5mm正中線上的位置處,牙科鉆頭顱骨鉆孔。取一根圓頭并帶有側(cè)孔的導管,與水平面成30度角,將導管沿正中線刺入,在距離顱底約2-3mm的地方停止,骨蠟封閉骨孔與導管之間縫隙以防止腦脊液露出。再將大鼠改為仰臥位,然后顯微鏡下解剖暴露右股動脈,抽取自體動脈血0.3ml,經(jīng)導管緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔。拔出導管,立即用骨蠟封閉骨孔,縫合頭皮。置30度頭低位約1小時后放入籠內(nèi)飼養(yǎng)�？瞻讓φ战M不做任何處理。 3動物處死和取材 在相應(yīng)的時間點將大鼠用4%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,對照組及SAH組每一亞組各取6只大鼠,經(jīng)心臟灌注等滲鹽水至肝臟發(fā)白后,開顱取腦。將腦組織-80℃液氮保存,用于Western blot及實時定量PCR檢測。其余6只大鼠經(jīng)心臟灌注等滲鹽水后,再用250ml4%多聚甲醛灌注,取腦,置于4%多聚甲醛中固定24h,用于免疫組化染色及免疫熒光雙染。 4Western blot analysis 在冰臺上分離顳葉腦組織,腦組織總蛋白的提取采用組織裂解法,提取的組織總蛋白定量后行Western blot檢測。將取得的顳葉組織分別加入2OmM Tris(包含0.2%SDS,1%Triton X100,1%deoxycholate,1mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF))和0.11IU/ml的抑肽酶。勻漿后在4℃、12000g的條件下離心20min。取上清液進行蛋白定量,并加入凝膠電泳上樣緩沖液,在95℃下水浴5分鐘。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)(90V)。分離后的蛋白按常規(guī)轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上(100V,90分鐘),5%的脫脂奶粉室溫下封閉2h,分別加入兔抗大鼠Ngb多克隆抗體(1：100,美國Santa Cruz公司)和兔抗大鼠p-actin多克隆抗體(1：3000,美國Bioworld公司)4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液洗膜后分別加入山羊抗兔IgG-HRP(1：5000,美國Bioworld公司),室溫下孵育2h,以增強化學發(fā)光法顯色陽性條帶,結(jié)果采用UN-SCAN-IT圖像分析軟件測量顯色陽性區(qū)的平均灰度值,用Ngb灰度值/β-actin灰度值表示Ngb相對表達水平,并統(tǒng)計分析。 5RNA的提取和實時定量PCR 在冰臺上分離顳葉的腦組織,腦組織總的RNA提取按照TRIZOL(TaKaRa公司,大連)試劑盒的說明書進行。用分光光度法測定260/280吸光度值。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總的RNA的純度。采用PrimiescriptTM RT試劑盒(TaKaRa公司,大連)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR反應(yīng)混合物采用20μl體系,包含10μl的SYBRPremix Ex Taq試劑,各0.4μl的正反引物(10μ mo1),2μl的cDNA及7.2μl無核酸酶的水。擴增的條件為：95℃預變性30min；95℃5s變性；65℃30s退火；75℃30s延伸,總共進行40個循環(huán)。實驗每個樣本分一主孔兩副孔,以CT值為衡量指標,每個目標基因與p-actin的比值得出不同時間點各目標基因的相對表達量,公式為R=2[ΔCT target (Normal-SAN)-ΔCTβ-actin (Norml-SAH)],并行統(tǒng)計學分析。 6免疫組化染色 將放置在4%多聚甲醛的腦組織常規(guī)石蠟包埋,并進行連續(xù)切片,切片厚度為4μm。常規(guī)石蠟切片脫蠟,水化,抗原修復后,5%BSA室溫下封閉30min后加入兔抗大鼠Ngb多克隆抗體(1：50)4℃孵育過夜。PBS洗15min×3次后用含1.6%H202的PBS封閉10分鐘。然后加入HRP標記的二抗室溫孵育1h。加DAB顯色應(yīng)用液染色10min,自來水沖洗,蘇木精復染,脫水,透明,封片。 7免疫熒光雙染 將4%多聚甲醛浸泡的腦組織分別用20%及30%的蔗糖溶液脫水。OCT膠包埋后連續(xù)切片,厚度為4分μm。冰凍切片在室溫下復溫30分鐘,Triton x-100室溫下孵育1小時,隨后用胎牛血清封閉1小時。封閉后用兔抗大鼠Ngb抗體(1：50)和小鼠抗大鼠NeuN抗體(1：200)；兔抗大鼠Ngb抗體(1：50)和小鼠抗大鼠GFAP抗體(1：200)；兔抗大鼠Ngb抗體(1：50)和小鼠抗大鼠Iba1抗體(1：500)分別加入到切片4℃過夜孵育。PBA洗脫后用Alexa Flour594山羊抗兔二抗和Alexa Flour488山羊抗小鼠二抗室溫下孵育2小時。最后加入DAPI對細胞核進行染色2分鐘,PBS洗脫后,熒光顯微鏡觀察并拍照。一抗洗脫后的所有步驟都在避光下進行。 8統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤(x±SEM)表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,差異具有統(tǒng)計學意義時進行SAH后各組與對照組間比較,采用Dunnett-t檢驗,均以P0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1動物實驗數(shù)量分析 84只大鼠進行實驗,l0只大鼠動物模型制備失敗,3只大鼠術(shù)后死亡,均予以剔除并隨機補充,最終納入分析仍為84只。 2SAH后Ngb蛋白水平升高 Ngb蛋白條帶出現(xiàn)在約17kDa的位置上,并呈動態(tài)變化。在對照組中,Ngb的蛋白表達量相對較低。SAH后,Ngb蛋白水平在3h時已經(jīng)開始升高,并在24h時達到高峰,隨后逐漸下降,至SAH后72h仍高于正常水平。與對照組相比,SAH后24h Ngb蛋白表達水平差異具有顯著性意義(P0.05),其余各亞組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。 3SAH后Ngb的mRNA水平提高 Ngb的mRNA含量在SAH后成動態(tài)變化,在對照組中,Ngb的含量相對較低,在SAH后的各亞組中,Ngb的mRNA水平從SAH后3h開始升高,6h達到高峰,峰值約達對照組的3倍,隨后開始逐漸下降。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示SAH后6h及12h組分別與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(p均小于0.01)。 4免疫組化染色分析Ngb表達 Ngb免疫反應(yīng)強陽性細胞呈深棕黃色,弱陽性成淺棕黃色。取SAH后24h組與對照組切片的顳葉皮質(zhì)進行對比觀察。對照組中Ngb免疫反應(yīng)陽性細胞相對較少,且陽性反應(yīng)較弱,而SAH后24h相同的區(qū)域內(nèi)胞漿Ngb陽性細胞數(shù)量均有不同程度的增多,染色亦較強,呈強陽性。除顳葉皮質(zhì)外,海馬、小腦及腦干均可發(fā)現(xiàn)Ngb免疫陽性細胞。切片中可發(fā)現(xiàn)典型的Ngb反應(yīng)陽性的神經(jīng)元,并可觀察到陽性染色主要分布在胞漿。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)SAH后24h組的Ngb免疫陽性細胞率為80.5%,對照組為55.3%,差異具有統(tǒng)計學意義。 5免疫熒光染色分析Ngb表達及分布 取SAH后24h組與對照組切片對比,結(jié)果顯示兩組切片內(nèi)均可見Ngb陽性細胞。相比之下,對照組熒光表達強度較弱,陽性細胞較少,而在SAH后24h組中,熒光強度增強,Ngb陽性細胞數(shù)增多。實驗中發(fā)現(xiàn)Ngb陽性染色主要在NeuN陽性細胞的胞漿,從得到的照片中統(tǒng)計,大約有98.9%Ngb陽性細胞同時也是NeuN陽性的細胞。進一步觀察可發(fā)現(xiàn)Ibal陽性細胞也有同時Ngb染色陽性的,有趣的是,并未發(fā)現(xiàn)有Ngb和GFAP同時陽性的細胞。 結(jié)論：1.本實驗利用視交叉池注血法模型模擬大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血,發(fā)現(xiàn)大鼠SAH后Ngb蛋白及基因在顳葉皮質(zhì)中的表達存在一定的時間-含量的變化規(guī)律,并且觀察到Ngb表達的細胞類型及細胞內(nèi)的表達位置。 2.Ngb在正常腦組織中含量相對較少,在SAH后存在一個時間-表達量的關(guān)系。在SAH后早期(3小時)及出現(xiàn)Ngb表達量的升高的趨勢,24小時時達到最高值,隨后逐漸下降,至72小時仍高于正常水平。 3.Ngb的mRNA水平在正常腦組織中的含量較少,但在SAH后3小時即迅速升高,6小時即達高峰,隨后呈下降趨勢,至72小時降至正常水平附近。 4.Ngb主要在大腦皮質(zhì)表達,在海馬及小腦中亦有表達。同時發(fā)現(xiàn),Ngb在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞的胞漿中表達,在星膠中并沒發(fā)現(xiàn)有表達。 5.本實驗證實了Ngb在大鼠神經(jīng)元胞漿中表達,同時發(fā)現(xiàn)其在小膠質(zhì)細胞中亦有發(fā)現(xiàn),在大鼠SAH后其表達量增加,具有時間-表達量關(guān)系。結(jié)合先前研究結(jié)果,我們推測Ngb在SAH中也發(fā)揮重要的作用,扮演神經(jīng)保護的角色。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.35

【參考文獻】

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1 王靜;王航雁;王萍;李茜;;宮內(nèi)窘迫新生兒血清腦紅蛋白的變化[J];實用兒科臨床雜志;2009年02期

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本文編號：2139593