【摘要】：目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是多發(fā)于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要是由于中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元變性死亡,造成其投射部位紋狀體內(nèi)多巴胺缺乏,引起帕金森病的一系列臨床表現(xiàn)[1]。近年對PD的研究也認為:氧化應(yīng)激、線粒體功能破壞、泛素蛋白酶體系統(tǒng)和溶酶體功能障礙造成的α-突觸核蛋白(α-synuclein)等異常聚集可能是DA神經(jīng)元變性死亡的重要因素[2-3]。由此而進行了一系列較為深入的保護多巴胺神經(jīng)元的研究,抑制DA神經(jīng)元變性卻并不能完全阻止帕金森病的發(fā)生和發(fā)展[4],軸突微管系統(tǒng)損傷在DA神經(jīng)元退行性變性和死亡中的作用逐漸引起我們的重視。本研究利用Vmat2轉(zhuǎn)基因斑馬魚和TH抗體標記DA神經(jīng)元的方法,在體實時觀察斑馬魚DA神經(jīng)元的定位分布及DA能神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,構(gòu)建斑馬魚DA神經(jīng)元逆行退變模型并探討變性死亡的機制,為帕金森病發(fā)病機制及軸突逆行性死亡機制的闡明提供實驗依據(jù)。方法通過熒光免疫組織化學(xué)法標記WT野生型斑馬魚腦部TH神經(jīng)元和使用激光共聚焦掃描顯微鏡掃描Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚頭部GFP標記的神經(jīng)元,在斑馬魚幼魚神經(jīng)系統(tǒng)形成時觀察其間腦腹側(cè)DA神經(jīng)元核團定位及形態(tài);在24h、30h、48h、54h、72h、4d、5d時連續(xù)活體實時觀察Vmat2魚及TH免疫熒光標記的WT野生型斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育;同時建立了MPTP誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元逆行退變模型,檢測了在50μM、100μM、200μM、400μM不同MPTP濃度下斑馬魚PD相關(guān)分子的m RNA表達水平;觀察了MPTP作用下DA神經(jīng)元胞體及軸突的變性死亡過程。結(jié)果1、斑馬魚間腦腹側(cè)的7群神經(jīng)細胞群(DC)中[5],構(gòu)成DC2和DC4細胞群的神經(jīng)元主要為DA神經(jīng)元;而構(gòu)成DC1、DC3、DC5和DC6細胞群的神經(jīng)元很可能并非DA神經(jīng)元;構(gòu)成斑馬魚前頂蓋區(qū)域和端腦區(qū)域的神經(jīng)元主要為DA神經(jīng)元;構(gòu)成斑馬魚藍斑和和中縫核區(qū)域很可能并沒有DA神經(jīng)元,為去甲腎上腺素(NA)神經(jīng)元。2、揭示了斑馬魚腦部(前腦、中腦、后腦)DA神經(jīng)元的發(fā)育過程。受精后24h,最先發(fā)現(xiàn)間腦腹側(cè)TPp區(qū)DC1/DC2群神經(jīng)元細胞為DA神經(jīng)元;48h時可見間腦腹側(cè)所有神經(jīng)群落分化完成,可見DC1~7細胞群落,以及后腦的藍斑、中縫核、端腦部位的神經(jīng)元細胞群落;胚胎發(fā)育到第3天的時候可以觀察到軸突,視前區(qū)視旁核后結(jié)節(jié)區(qū)(TPp)DC2細胞群的軸突投射到端腦部位;斑馬魚發(fā)育4d時神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完全,所有細胞群可被觀測到。在Vmat2轉(zhuǎn)基因斑馬魚中,可以活體實時觀察DA神經(jīng)元的連續(xù)發(fā)育,發(fā)現(xiàn)TPp區(qū)DA神經(jīng)元的數(shù)量在發(fā)育過程中先增多后減少。發(fā)現(xiàn)從開始發(fā)生到系統(tǒng)定形,神經(jīng)元的位置發(fā)生了遷移。3、成功構(gòu)建了Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚活體實時動態(tài)觀察PD模型,激光共焦顯微鏡活體觀察神經(jīng)元及軸突變性過程,發(fā)現(xiàn)了不同濃度MPTP對DA神經(jīng)元胞體及軸突退行病變的作用。在濃度為200μM和400μM的時候,斑馬魚行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的變化最為明顯;本研究構(gòu)建的斑馬魚活體實時PD模型,其行為學(xué)、形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)改變與小鼠PD動物模型基本一致。4、首次活體觀察到Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型間腦腹側(cè)TPP區(qū)域存在向下皮層投射的軸突;在高濃度MPTP的作用下,TPP區(qū)域的DA神經(jīng)元軸突的死亡早于神經(jīng)元胞體;篩查了已知與帕金森病明確相關(guān)的重要基因表達變化。采用不同濃度MPTP處理Vmat2:GFP斑馬魚胚胎,發(fā)現(xiàn)在100μM時,DA神經(jīng)元形態(tài)未發(fā)生變化前PD相關(guān)分子已經(jīng)有了變化,其中Pink1及DJ-1基因表達變化最為明顯,隨MPTP濃度升高而降低。結(jié)論1、通過活體觀察Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚,對比野生型斑馬魚的TH免疫組織化學(xué)染色和Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚綠色熒光顯示,我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚間腦腹側(cè)7個神經(jīng)元群中[6],構(gòu)成DC2區(qū)和DC4區(qū)的神經(jīng)元主要為DA神經(jīng)元。另外頂蓋區(qū)和端腦區(qū)的神經(jīng)元也主要為DA神經(jīng)元。修正和完善了斑馬魚DA神經(jīng)元在腦部的定位和分布。2、對DA神經(jīng)元的發(fā)生及發(fā)育首次進行了系統(tǒng)的研究,揭示了腦部(前腦、中腦、后腦)DA神經(jīng)元的發(fā)育過程。受精后24h,最先發(fā)現(xiàn)間腦腹側(cè)TPp區(qū)DC1/DC2群神經(jīng)元細胞為DA神經(jīng)元;48h時可見間腦腹側(cè)所有神經(jīng)群落分化完成,可見DC1~7細胞群落,以及后腦的藍斑、中縫核、端腦部位的神經(jīng)元細胞群落;第3天時可以觀察到軸突,視前區(qū)視旁核后結(jié)節(jié)區(qū)(TPp)DC2細胞群的軸突投射到端腦部位;4d時神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完全,所有細胞群可被觀測到。3、在Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中,可以活體實時觀察DA神經(jīng)元的連續(xù)發(fā)育,TPp區(qū)DA神經(jīng)元的數(shù)量在發(fā)育過程中先增多后減少;DA神經(jīng)元從開始發(fā)生到系統(tǒng)定形,神經(jīng)元的位置發(fā)生了遷移;研究Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的DA神經(jīng)元的分布與發(fā)育,為下一步建立活體實時觀察斑馬魚軸突逆行性退變模型奠定了基礎(chǔ)。4、成功構(gòu)建了Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚活體實時動態(tài)DA神經(jīng)元逆行退變PD模型,活體觀察神經(jīng)元及軸突變性過程,發(fā)現(xiàn)了不同濃度MPTP對DA神經(jīng)元胞體及軸突退行病變的作用。在濃度為200μM和400μM的時候,斑馬魚行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的變化最為明顯;本研究構(gòu)建的斑馬魚動物活體實時觀察PD模型,其行為學(xué)、形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)改變與小鼠PD動物模型基本一致,表明我們構(gòu)建的斑馬魚動物模型可用來PD發(fā)病機制的研究。5、活體觀察到Vmat2:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型間腦腹側(cè)TPP區(qū)域存在向下皮層投射的軸突;在100μM時,DA神經(jīng)元形態(tài)未發(fā)生變化前PD相關(guān)分子已經(jīng)有了變化,其中Pink1及DJ-1基因表達變化最為明顯,隨MPTP濃度升高而降低。TPp區(qū)域的DA神經(jīng)元軸突早于神經(jīng)元胞體的死亡,印證了我們提出的軸突逆行性死亡假說。證明在軸突逆行退變模型中,PD相關(guān)分子Pink1、DJ-1、LRRK2及Parkin分子影響著軸突逆行退變。
[Abstract]:Objective Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease in middle - aged and old age . In recent years , the development of DA neurons in the brain of zebrafish was investigated by fluorescence immunohistochemical method . In the transgenic zebrafish of Vmat2 : GFP transgenic zebrafish ( Vmat2 : GFP transgenic zebrafish ) was observed . In order to establish a real - time dynamic DA neuron degeneration model for zebra fish , the changes of DA neurons were observed in vivo . The results showed that the expression of DA neurons in the Vmat2 : GFP transgenic zebrafish was more obvious than that of the mouse PD model .
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

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本文編號：2131573