【摘要】：研究背景和目的 腦膠質(zhì)瘤約占腦內(nèi)腫瘤的40%～50%,具有高侵襲性、高度增殖性,傳統(tǒng)手術(shù)加放、化療等綜合治療手段主要針對的是腫瘤細(xì)胞,療效欠佳,而一直以來所采用的抗腫瘤血管生成的治療策略也未見明顯療效。1999年,Maniotis等發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象(vasculogenic mimicry, VM),即腫瘤細(xì)胞可以在特定情況下模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞形成一種功能上類似于正常血管的通道,形成另一腫瘤供血系統(tǒng),提示抑制這一血供可能成為腫瘤血管靶向治療的新靶點(diǎn)。血管生成擬態(tài)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),為膠質(zhì)瘤綜合治療提供了更多的思路和方法。 有關(guān)VM形成機(jī)制目前尚未十分明確。最新的研究認(rèn)為,VM形成與腫瘤微環(huán)境改變密切相關(guān)。深入研究膠質(zhì)瘤微環(huán)境的改變將有助于進(jìn)一步了解VM形成機(jī)制,探討治療方法的多樣性和有效性。 腫瘤微環(huán)境指的是腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及所分泌的活性介質(zhì)等與腫瘤細(xì)胞共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境。缺氧與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成了微環(huán)境的主要組成內(nèi)容；而細(xì)胞間質(zhì)高壓形成、組織缺氧和酸中毒、大量生長因子和蛋白水解酶的產(chǎn)生等構(gòu)成了腫瘤組織代謝環(huán)境的生物學(xué)特征。這種特性對于腫瘤的增殖、侵襲、新生血管的形成、凋亡等均具有重要影響。 缺氧是腫瘤微環(huán)境重要的組成部分。腫瘤細(xì)胞的生長和增殖有賴于充分的氧氣和能量供應(yīng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞失控性生長和增殖時,消耗了大量的營養(yǎng)和氧氣。由于尚未及時建立有效的新生血管網(wǎng),或新生血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能處于異常狀態(tài),氧的供應(yīng)遠(yuǎn)少于氧的需求,腫瘤細(xì)胞處于急性(灌注缺乏)或慢性(彌漫障礙)缺氧狀態(tài)。而缺氧狀態(tài)下,由于多種分子的作用,進(jìn)一步影響了腫瘤細(xì)胞的增殖、新生血管形成、凋亡等生物學(xué)行為。目前發(fā)現(xiàn),這些分子主要包括有缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、整合素、鈣粘連素、免疫球蛋白類粘附分子、選擇素、抗凋亡蛋白等。 缺氧狀態(tài)下,這些分子也參與了腫瘤細(xì)胞VM的形成,包括有HIF-1α、 MMPs、VEGF、Bcl-2等。研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α參與多種實(shí)體腫瘤VM的管道形成,主要通過以下途徑：(1)HIF-1α能夠調(diào)控EphA2/PI3K/MMPs信號途徑影響VM形成。張詩武等對人眼葡萄球黑色素瘤VM形成過程研究中,發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下,腫瘤細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α,可上調(diào)MMP-2和MMP-9分子表達(dá),降解ECM,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和VM形成；(2) HIF-1α還能夠受到PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響參與調(diào)控VM的形成。有研究發(fā)現(xiàn)mTOR特異性抑制劑雷帕霉素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中的HIF-1α,提示雷帕霉素通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR及HIF-1α途徑影響VM形成。由此可見,HIF-1α在VM形成過程中扮演了非常重要的角色,對HIF-1α的深入研究及多靶點(diǎn)聯(lián)合抑制HIF-1α將是我們未來抗血管生成擬態(tài)形成的重要研究方向。 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2分子(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)也被證實(shí)影響人眼葡萄球黑色素瘤細(xì)胞VM形成。實(shí)驗(yàn)顯示,缺氧微環(huán)境中Bcl-2與VEGF表達(dá)上調(diào)；當(dāng)沉默Bcl-2后,VEGF表達(dá)明顯下調(diào),VM形成明顯受抑制。因此,Bcl-2也可能是抑制腫瘤細(xì)胞VM形成的靶點(diǎn)。 近年來,有學(xué)者報道了缺氧對腦膠質(zhì)瘤VM管道形成的影響。2011年張熙等發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44在缺氧條件下形成的血管生成擬態(tài)中,VEGF、 EphA2、MMP2、MMP9表達(dá)明顯增強(qiáng),提示缺氧條件下,HIF-1α有可能通過影響VEGF、EphA2、MMPs等分子表達(dá)來參與VM的形成。2012年奚再興等報道缺氧能促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞VM形成,誘導(dǎo)HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。由此可見,HIF-1α、MMPs、抗凋亡蛋白等多種分子在膠質(zhì)瘤VM形成中起著重要作用。 在腫瘤的靶向治療中,VM相關(guān)分子特異性抑制劑的作用日益受到重視。其中,HIF-1α特異性抑制劑3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑{3-(5-hydroxymethl-2-furyl)-1-benzylindazole, YC-1}被證實(shí)對多種腫瘤如胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌等具有優(yōu)越的抗血管新生活性及腫瘤治療活性,并呈現(xiàn)有劑量依從性。而Bcl-2特異性抑制劑也被認(rèn)為是抗血管新生的有效藥物之一,通過調(diào)控Bcl-2表達(dá)從而影響VM的形成。 目前未見YC-1影響膠質(zhì)瘤VM形成的報道,但有研究已證實(shí)了YC-1可影響膠質(zhì)瘤的血管新生。2012年,意大利Marizia B教授對誘導(dǎo)缺氧條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的細(xì)胞生長、血管新生等細(xì)胞生物學(xué)改變進(jìn)行了研究。結(jié)果表明YC-1通過抑制HIF-1α分子的表達(dá),進(jìn)一步抑制MMPs分子表達(dá),從而減少了U87細(xì)胞的血管新生。 因此,缺氧如何影響膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成,以及應(yīng)用HIF-1α特異性抑制劑YC-1能否抑制缺氧膠質(zhì)瘤細(xì)胞VM形成,都值得我們探討。 本研究采用化學(xué)模擬缺氧法誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞缺氧微環(huán)境,探討缺氧條件下U87細(xì)胞VM形成及相關(guān)分子的表達(dá)。隨后,應(yīng)用不同濃度YC-1對HIF-1α進(jìn)行抑制,探討YC-1影響U87細(xì)胞VM形成情況及相關(guān)分子表達(dá),并分析其可能機(jī)制。最后,應(yīng)用YC-1及Bcl-2特異性抑制劑,探討雙藥物多靶點(diǎn)治療對缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM的抑制作用及可能機(jī)制。研究目的為改進(jìn)抗惡性膠質(zhì)瘤血管生成策略提供新的思路,為尋找聯(lián)合作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ),從而擴(kuò)展治療手段,提高膠質(zhì)瘤治療生存率。 第一章缺氧對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成及相關(guān)分子的影響 目的構(gòu)建模擬缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察U87細(xì)胞的血管生成擬態(tài)情況,分析HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2等相關(guān)分子表達(dá),為研究模擬缺氧U87細(xì)胞血管生成擬態(tài)的作用機(jī)制及HIF-1α靶向抑制治療提供基礎(chǔ)。 方法人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、三維培養(yǎng)。建立對照組和缺氧組。缺氧組每孔加入二氯化鈷(CoCl2)100μmol/L。兩組24h終止培養(yǎng)。觀察各組細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度：用倒置顯微鏡下(×100)隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個視野攝像記錄并計數(shù)管狀結(jié)構(gòu)的總長度,取每個視野的均值。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測兩組HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表達(dá)。 結(jié)果血管計數(shù)：24小時培養(yǎng)后對照組細(xì)胞生長序列紊亂,無明顯規(guī)律,僅能發(fā)現(xiàn)少數(shù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而缺氧組細(xì)胞相互連接,融合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),呈單個環(huán)或多個環(huán)連接的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。鏡下觀察,對照組平均每視野網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量為2946.355±114.795μm,缺氧組為4244.161±79.686μm,兩組有顯著性差異(P0.05)。 RT-PCR檢測：(1)對照組HIF-1α為2.888±0.187,缺氧組為6.723±0.419,組間有顯著性差異(t=-14.483,P0.05)。(2)對照組MMP-2為4.077±0.676,缺氧組為4.636±0.51,組間無顯著性差異(t=-1.143,P0.05)。(3)對照組MMP-14為2.766+0.074,缺氧組為4.995±0.313,組間有顯著性差異(t=-12.014,P0.05)。(4)對照組Bcl-2為2.796+0.249,缺氧組為3.772±0.953,組間有顯著性差異(t=-6.349,P0.05)。 結(jié)論缺氧能促進(jìn)U87細(xì)胞VM形成。缺氧條件下可能通過上調(diào)細(xì)胞HIF-1α分子表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)MMP-14, Bcl-2分子的表達(dá),可能與缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM的形成相關(guān)。 第二章不同濃度YC-1對缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成及相關(guān)分子表達(dá)的影響 目的觀察應(yīng)用不同濃度YC-1對缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成的影響,探討不同YC-1實(shí)驗(yàn)濃度對缺氧膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)相關(guān)分子表達(dá)的影響。 方法人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)及三維培養(yǎng),依照常氧或缺氧條件下加入0、10、50umol/L的YC-1分為常氧對照組、常氧YC-1-10組、常氧YC-1-50組、缺氧對照組、缺氧YC-1-10組、缺氧YC-1-50組共六組。缺氧組每孔加入二氯化鈷(CoCl2)100μmol/L。所有細(xì)胞組經(jīng)培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng)。觀察加入YC-1組VM形成情況并與對照組比較。提取各組U87細(xì)胞的RNA。RT-PCR檢測各組HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表達(dá)的差異。用Western blot技術(shù)分析各組U87細(xì)胞HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2的活性程度。 結(jié)果血管計數(shù)：缺氧24h培養(yǎng)后,加入YC-1后可見少數(shù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),較未加入YC-1者減少；YC-1-10組血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較YC-1-50組平均每視野網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著減少(P0.05)。常氧24h培養(yǎng)后,加入YC-1后可見極少數(shù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),較未加入YC-1者減少；YC-1-10組血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)較YC-1-50組的平均每視野網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著減少(P0.05)。 RT-PCR檢測：(1)加入YC-l后,缺氧組與常氧組之間HIF-1α分子表達(dá)有顯著差異(F=104.001,P0.001)。YC-1均顯著下調(diào)常氧組與缺氧組內(nèi)HIF-1α分子的表達(dá),在常氧組呈劑量依從性(P0.05),而缺氧組無劑量依從性(P0.05)。(2)加入YC-1后,缺氧組與常氧組之間MMP-2分子表達(dá)無顯著差異(F=2.353,P=0.1510.05). YC-1均顯著下調(diào)常氧組與缺氧組內(nèi)MMP-2分子的表達(dá),常氧組無劑量依從性(P0.05),缺氧組有劑量依從性(P0.05)。(3)加入YC-1后,缺氧組與常氧組之間MMP-14分子表達(dá)有顯著性差異(F=35.515,P0.001). YC-1均顯著下調(diào)常氧組與缺氧組內(nèi)MMP-14分子的表達(dá),常氧組有劑量依從性(P0.05),缺氧組無劑量依從性(P0.05)。(4)加入YC-1后,缺氧組與常氧組之間Bcl-2分子表達(dá)有顯著差異(F=25.816, P0.001)。YC-1均顯著下調(diào)常氧組與缺氧組內(nèi)Bcl-2分子的表達(dá),兩組均有劑量依從性(P0.05)。 Western blot技術(shù)檢測：(1)加入YC-1的常氧組及缺氧組經(jīng)培養(yǎng)24h后,可見HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子減少。(2)加入不同濃度的YC-1后,常氧條件下Bcl-2蛋白無明顯差異；缺氧條件下高濃度的YC-1組內(nèi)MMP-2、 Bcl-2分子表達(dá)低于低濃度YC-1組。 結(jié)論YC-1對缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成有抑制作用,隨濃度增大而增強(qiáng)。 YC-1顯著下調(diào)缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表達(dá)；YC-1對MMP-2、Bcl-2的抑制效果隨YC-1作用濃度增大而增強(qiáng)。 第三章YC-1與Bcl-2抑制劑對缺氧人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成的影響及可能機(jī)制 目的觀察應(yīng)用YC-1、Bcl-2抑制劑(ABT-737)對缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成的影響,研究HIF-1α及ABT-737對相關(guān)分子表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討缺氧U87細(xì)胞VM的機(jī)制及多靶點(diǎn)治療的意義。 方法細(xì)胞分為對照組、YC-1組、ABT-737組、(YC-1+ABT-737)雙抑制組。誘導(dǎo)缺氧培養(yǎng)24h。觀察各組細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)排列情況和完整程度,計算管狀結(jié)構(gòu)的總長度。應(yīng)用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測各組HIF-1α MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子的表達(dá)。 結(jié)果血管計數(shù)：(1)四個組間之間VM總長度有顯著性差異(F=105.267, P0.001). YC-1組、ABT-737組、YC-1+ABT-737組VM總長度依次為2836.638±151.301μm,3815.453±22.917μm,2484.528±164.137μm,均顯著少于對照組(P0.05)。(2)與YC-1+ABT-737雙抑制組比較,YC-1組或ABT-737組的VM總長度均有顯著性差異(P0.05)。 RT-PCR檢測：(1)四個組別之間比較：HIF-1α、MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表達(dá)均有顯著性差異(P0.001)。(2)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,HIF-1α MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05)。(3)與YC-1+ABT-737雙抑制組比較：YC-1組及ATT-737組內(nèi)的HIF-1α、MMP-2、Bcl-2分子表達(dá)均有顯著性增加(P0.05)；ATT-737組內(nèi)MMP-14分子表達(dá)顯著性增加(P0.05),但YC-1組MMP-14分子表達(dá)無顯著性差異(P0.05)。 Western blot檢測：(1)與對照組相比,YC-1組、YC-1+ABT-737組的HIF-1α MMP-2、MMP-14、Bcl-2分子表達(dá)均下降；ABT-737組的MMP-2、Bcl-2分子表達(dá)下降,但HIF-1α、MMP-14分子無明顯下降。(2)與(YC-1+ABT-737)雙抑制組相比,ABT-737組的HIF-1α、MMP-14分子表達(dá)升高；YC-1組的HIF-1α、MMP-2、MMP-14分子無明顯差別,但Bcl-2分子表達(dá)較高。 結(jié)論單純加入YC-1、單純加入ABT-737或同時加入YC-1與ABT-737,均可顯著抑制缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成；同時加入YC-1及ABT-737者抑制VM形成更顯著。 Bcl-2是抑制缺氧膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞VM形成的一個有效靶點(diǎn)。 YC-1聯(lián)合ABT-737的雙藥物多靶點(diǎn)治療,抑制VM形成效果優(yōu)于單藥物治療。雙抑制作用可能通過顯著下調(diào)HIF-1α、MMP-2、Bcl-2分子的表達(dá)來完成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郜明;吳家明;陸茵;;腫瘤微環(huán)境與腫瘤的惡變[J];癌變.畸變.突變;2008年05期

2 楊群英;陳忠平;;惡性膠質(zhì)瘤分子靶向藥物聯(lián)合治療新動態(tài)[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2007年04期

3 王華民;楊學(xué)軍;;血管生成擬態(tài)及其在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2011年02期

4 李聰;陳銀生;陳忠平;;血管生成擬態(tài)及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2011年04期

5 仲萍萍;夏云飛;;微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2006年01期

6 權(quán)晶晶;凌均h，

本文編號：2130282