【摘要】：大多神經(jīng)退行性疾病是由于細(xì)胞內(nèi)具有聚集傾向的病變蛋白的堆積造成的。真核細(xì)胞的蛋白代謝途徑主要包括泛素蛋白酶體途徑和自噬途徑兩種。而由于蛋白聚集體本身的尺寸較大,無(wú)法通過(guò)蛋白酶體的降解腔進(jìn)行降解,自噬則成為其主要的降解途徑。因此,通過(guò)提高自噬水平來(lái)加強(qiáng)對(duì)蛋白聚集體的降解能力是治療神經(jīng)退行性疾病的有效方案。之前有研究報(bào)道富勒烯納米材料可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬提高及抗氧化作用緩解Aβ蛋白對(duì)細(xì)胞的毒害作用。碳納米管也被報(bào)道可以恢復(fù)病變神經(jīng)細(xì)胞的自噬能力。氧化石墨烯作為近年來(lái)被研究較多的碳基納米材料因具有特殊的較好的生物相容性,豐富的表面基團(tuán),較大的表面積及獨(dú)特的光熱效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究。在本文中發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米材料可以有效促進(jìn)亨廷頓細(xì)胞模型中病變亨廷頓(huntingtin)蛋白聚集體的清除。首先我們通過(guò)經(jīng)典Hummers方法合成氧化石墨烯并通過(guò)原子力顯微鏡、紫外可見(jiàn)分析光譜、傅里葉紅外光譜等對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了表征。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果與報(bào)道一致,氧化石墨烯對(duì)細(xì)胞的毒副作用非常小。之后的實(shí)驗(yàn)中我們利用免疫印跡及熒光顯微鏡同時(shí)證明了氧化石墨烯所具有的促進(jìn)病變亨廷頓(huntingtin)蛋白清除的現(xiàn)象并通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),自噬上下游抑制劑及自噬相關(guān)基因的敲除都能抑制氧化石墨烯對(duì)病變亨廷頓(huntingtin)蛋白的清除作用而蛋白酶體的抑制劑卻不能對(duì)其起到抑制效果,這證明氧化石墨烯的這一作用是自噬途徑依賴的而非蛋白酶體途徑依賴的。進(jìn)一步地,我們更加全面、系統(tǒng)的檢測(cè)了氧化石墨烯引發(fā)細(xì)胞自噬的能力,結(jié)果顯示其可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)換,自噬體的形成等常見(jiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象,卻不能誘導(dǎo)p62的降解,這與相關(guān)報(bào)道一致,但游離GFP的釋放及抑制自噬下游通路后自噬體的積累實(shí)驗(yàn)則證明氧化石墨烯引發(fā)的細(xì)胞自噬流是完整的。在自噬機(jī)理方面的研究中,首先我們證明了與之前報(bào)道的Becline一樣,作為復(fù)合物中的另一分子PtdIns3K也在GO引發(fā)的自噬中起重要作用。其次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氧化石墨烯引發(fā)的細(xì)胞自噬是mTOR非依賴的。另外我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧化石墨烯處理后的細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化水平明顯上升,并且ERK抑制劑可以抑制其引發(fā)的自噬效應(yīng)。說(shuō)明GO引發(fā)的細(xì)胞自噬是mTOR非依賴的及ERK依賴的。最后我們對(duì)氧化石墨烯清除病變亨廷頓(huntingtin)蛋白的機(jī)理進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧化石墨烯處理后細(xì)胞內(nèi)的泛素化水平明顯升高,免疫共沉淀及體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,氧化石墨烯更傾向于結(jié)合泛素化的蛋白,同樣相對(duì)于未泛素化的病變亨廷頓蛋白,也更傾向于結(jié)合其泛素化形式。結(jié)合透射顯微鏡結(jié)果所顯示的細(xì)胞內(nèi)大量包含材料的自噬泡的出現(xiàn),我們得出結(jié)論,氧化石墨烯很可能直接與泛素化的病變亨廷頓蛋白結(jié)合后將其帶至自噬體內(nèi)并與溶酶體融合使蛋白聚集體進(jìn)行降解。綜上所述,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)了氧化石墨烯在即清除病變蛋白聚集體方面的應(yīng)用,并初步揭示了其機(jī)理,為納米材料應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療相關(guān)方面研究提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:It is found that graphene oxide nano - material can effectively promote the removal of huntingtin protein aggregates in Huntington ' s cell model .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O613.71;R741

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2129204