【摘要】：目的：本部分研究旨在通過攜帶RNA干擾(RNAi)的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,探討其對腺苷激酶(ADK)的干擾作用,為后續(xù)實驗提供研究工具。方法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),攜帶ADK相關(guān)RNAi (P236)的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs,根據(jù)GFP表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)確定慢病毒轉(zhuǎn)染的最佳感染復(fù)數(shù)(M0I),以對照病毒轉(zhuǎn)染的MSCs作為對照,通過免疫熒光和western blot定性定量分析RNA干擾引起的MSCs中ADK含量的變化,并用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒分析腺苷含量變化。結(jié)果：全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)且均一,呈長梭形,雜質(zhì)細(xì)胞少,活性佳。慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)為30,感染效率為93.6±4.2%。 western blot顯示：與對照組相比,RNAi (P236)可以使腺苷激酶的表達(dá)下降53%,免疫熒光檢測進一步表明也RNAi可以下調(diào)腺苷激酶的表達(dá)。利用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒分析105個ADK下調(diào)的MSCs孵育8小時每毫升培養(yǎng)液增加13.8 ng腺苷。結(jié)論：RNA干擾(p236)可有效沉默大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中腺苷激酶的表達(dá),并使腺苷含量增加。目的：本研究探討腺苷激酶的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在鋰-匹羅卡品癲癇模型中的抗癲癇作用和神經(jīng)保護作用。方法：慢病毒攜帶的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記MSCs,分別將ADK--MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠雙側(cè)海馬,移植一周后腹腔注射匹羅卡品制作癲癇模型,隨機選取移植ADK--MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受體拮抗劑DPCPX注射并維持整個實驗過程。其后分別于造模急性期(1天)、慢性期(30天)進行行為學(xué)(造模時癲癇發(fā)作情況、自發(fā)性癲癇發(fā)作頻率監(jiān)測)、電生理(EEG)以及免疫組織化學(xué)(冰凍切片尼氏染色,TUNEL染色)研究大鼠癲癇發(fā)作情況、腦電圖變化和海馬神經(jīng)元變化。結(jié)果：匹羅卡品誘發(fā)了control-MSCs移植大鼠的癲癇持續(xù)狀態(tài)和隨后的自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作以及海馬神經(jīng)元凋亡和丟失。ADK基因沉默的MSCs移植減少了癲癇持續(xù)狀態(tài)半小時內(nèi)V級發(fā)作的總時間并減少了后期的自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作次數(shù)及癲癇波的頻率；造模后一天,TUNEL染色示陽性細(xì)胞數(shù)減少、western blot示caspase-3活性降低,造模后30天尼氏染色示海馬神經(jīng)元丟失程度減少了33%。而接受DPCPX的ADK MSCs移植組沒有這些改善。結(jié)論：腺苷激酶基因沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可阻礙大鼠癲癇自發(fā)性發(fā)作的發(fā)生發(fā)展以及改善海馬神經(jīng)元損傷,而這種治療作用是由于移植細(xì)胞釋放的腺苷激活A(yù)1R。目的：評價匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠顳葉癲癇模型認(rèn)知功能,研究ADK沉默的細(xì)胞移植對此癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響。方法：分別將ADK- -MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠雙側(cè)海馬,移植一周后腹腔注射匹羅卡品制作癲癇模型,隨機選取移植ADK- -MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受體拮抗劑DPCPX注射并維持整個實驗過程。其后于造模后4周進行水迷宮實驗和新物辨認(rèn)實驗來評估ADK沉默的細(xì)胞移植對鋰-匹羅卡品癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響。結(jié)果：在連續(xù)5天的水迷宮訓(xùn)練中,隨著訓(xùn)練時間延長,正常大鼠尋找水下隱匿平臺的策略逐漸完善,找到水下隱匿平臺的時間(逃逸潛伏期)逐漸縮短,而癲癇大鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力下降。與TLE-cont和SHAM組相比,ADK沉默MSCs移植組實驗動物逃逸潛伏期明顯縮短,能更快地找到逃生平臺,學(xué)習(xí)能力更強,接近于未造模正常大鼠的水平;空間探索實驗中,相比TLE-cont和SHAM組大鼠,ADK- -MSCs組大鼠穿梭平臺的次數(shù)更多,然而AD K沉默MSCs移植后接受注射腺苷A1受體拮抗劑(DPCPX)組大鼠沒有此變化。新物辨認(rèn)實驗中,相比未造模的正常大鼠,TLE大鼠對新物體探索的相對時間減少,而ADK-MSCs移植可改善這種減少,接受DPCPX后這種改善消失。對新物體探索的頻率與對新物體探索的時間具有相似趨勢,但沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的顳葉癲癇大鼠存在認(rèn)知功能障礙；ADK沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能有效改善鋰-匹羅卡品癲癇大鼠的認(rèn)知障礙,并通過腺苷A1受體發(fā)揮作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of adenosine kinase ( ADK ) on the expression of adenosine kinase in rat bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) by immunofluorescence and western blot . The results showed that RNA interference ( p236 ) could decrease the expression of adenosine kinase in rat bone marrow mesenchymal stem cells .
The effects of ADK - MSCs and control - MSCs on the cognitive function of epileptic rats were studied . The results showed that ADK - MSCs and control - MSCs were transplanted into adult SD rats .
ADK - silenced mesenchymal stem cell transplantation can effectively improve cognitive impairment in epileptic rats with lithium - pilocarpine and play a role in adenosine A1 receptor .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1;R749.1

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本文編號：2118643