發(fā)布時間：2018-07-07 23:44

  本文選題：腦缺血 + 腦缺血再灌注損傷��； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的 缺血性腦血管病占腦血管病80%左右,其最有效的治療是及時恢復(fù)缺血腦組織區(qū)域的血液灌注。但是,在發(fā)病后4.5小時的溶栓治療時間窗內(nèi)來到醫(yī)院的病人尚不足5%,同時溶栓后引起顱內(nèi)及顱外臟器出血及其它副作用等也限制了超早期溶栓的應(yīng)用。采取有效的腦保護(hù)措施,盡最大可能降低缺血再灌注(ischemical reperfusion,I/R)損傷至關(guān)重要。缺血預(yù)處理及缺血后處理可以激發(fā)機體內(nèi)潛在的保護(hù)機制,減輕腦卒中后的腦組織損傷。在心肌缺血損傷實驗中首先提出了缺血預(yù)適應(yīng),即一個器官在嚴(yán)重的缺血事件之前,預(yù)先給予一個短暫的輕度的缺血預(yù)處理,能對隨后發(fā)生的高危的腦缺血事件產(chǎn)生耐受性。此種預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象也可以保護(hù)腦缺血損傷,稱為腦缺血耐受。但是,急性缺血性事件的發(fā)生時間不能事先預(yù)知,所以采取缺血預(yù)適應(yīng)措施在臨床現(xiàn)實中可能無法應(yīng)用。缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning,IP)頃應(yīng)臨床實際的要求而產(chǎn)生了。IP的概念最早是在大鼠的冠脈缺血模型研究中被發(fā)現(xiàn),在閉塞的冠狀動脈恢復(fù)再灌注之前,對該冠狀動脈進(jìn)行多次短時間的缺血再灌注處理,可以使心肌梗死的體積降低。IP就是指在I/R的早期階段,對缺血的器官本身采取短程的輕度、非致命性的缺血,該種措施可以使缺血組織對I/R產(chǎn)生適應(yīng)性及耐受性。后期實驗證實缺血后適應(yīng)在腦缺血中亦存在。 雖然IP可以在缺血事件發(fā)生后實施,但在起初的實驗階段,研究者對缺血器官本身的采取后處理措施,而腦組織等器官耗氧量高,對缺血和缺氧非常敏感,難以控制IP的處理方式和應(yīng)用時間,實際工作中不容易進(jìn)行。后來在小鼠冠脈的I/R模型中發(fā)現(xiàn),對腎動脈采取缺血后處理可以有效地降低心肌梗死的體積,緩和心肌I/R損傷,隨之產(chǎn)生了遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)(remote ischemic postconditioning,RIP)的概念。也就是說,在器官A出現(xiàn)缺血事件之后,對器官A以外器官B應(yīng)用缺血后處理,這種處理措施可以降低器官A的再灌注性損傷。腎臟最先被研究可以產(chǎn)生遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng),但是腎臟位置較深,副損傷較大,不易實施。隨后發(fā)現(xiàn)下肢動脈也可以實施遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng),并先后在心肌和腦的缺血再灌注損傷動物模型中被證實。RIP的產(chǎn)生可能為激發(fā)體內(nèi)內(nèi)源性的保護(hù)機制,增強腦組織對缺血的耐受力,減輕I/R損傷。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)的后處理器官位于下肢,下肢血管位置表淺,易于操作,副損傷小,操作容易,且其能耐受較高強度的缺血缺氧,觀察和評估缺血的程度亦簡單,更加容易應(yīng)用于腦I/R的保護(hù)機制研究,可成為可行的缺血后處理的新思路、新途徑。 腦缺血—再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)的機制包括氧自由基過度產(chǎn)生的損傷作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、過度炎性反應(yīng)、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性作用、細(xì)胞凋亡等諸多方面,且多種機制間存在錯綜復(fù)雜的相互作用和相互影響。諸多發(fā)生機制中,炎性反應(yīng)是CIRI中至關(guān)重要的一方面,發(fā)揮著始動作用及后續(xù)的損傷作用。炎性反應(yīng)過程中伴隨著大量炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,其中包括重要的白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)。一般情況下,IL按其功能可以分為促炎性和抑炎性兩類,但也不盡其然,同一細(xì)胞因子在炎癥的不同階段、不同的表達(dá)程度下可能有截然相反的作用。通常情況下IL-1β被認(rèn)定為最重要的促炎性因子,目前已被廣泛研究。而IL-1受體拮抗劑(Interleukin-1receptor antagonist,IL-1Ra)是唯一在機體內(nèi)產(chǎn)生的對IL-1活性產(chǎn)生特異性抑制的細(xì)胞因子,其同時具有競爭性和選擇性,屬于抑炎性細(xì)胞因子,其可對抗缺血—再灌注后的過度炎性反應(yīng),達(dá)到減輕缺血—再灌注損傷的作用。缺血再灌注損傷的急性期階段,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死并存,而在數(shù)小時至數(shù)天,發(fā)展到遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death, DND),神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡為其主要形式。Bcl-2家族在CIRI中對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響已被大量的實驗所證實。Bcl-2是目前研究最多的、最主要的抗凋亡基因,其抑制細(xì)胞凋亡的功能可能是通過抑制自由基的過度生成、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制Caspases的激活、增強細(xì)胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性等一系列機制而產(chǎn)生的。而Bax與Bcl-2存在高度同源的結(jié)構(gòu)域,通過形成Bax-Bax同源二聚體,抑制Bcl-2的功能,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 本實驗運用線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO/R模型,通過探討夾閉雙側(cè)股動脈的RIP對大鼠I/R后神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、腦組織含水量、病理組織學(xué)、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、IL-1β mNA和IL-1Ra mRNA表達(dá)的影響,進(jìn)一步明確RIP對CIRI產(chǎn)生保護(hù)作用的有效性和產(chǎn)生機制,為后期臨床腦保護(hù)治療提供理論依據(jù)。 方法 依據(jù)隨機原則,將147只健康的清潔級10周齡雄性SD大鼠均分為3組：假手術(shù)組(sham-operated group)、模型組(model group)和遠(yuǎn)隔缺血后處理組(RIP group),每組各49只。在模型組和RIP組大鼠中,應(yīng)用目前被廣泛認(rèn)可的線栓法,造模出右側(cè)大腦中動脈缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型。RIP組在大腦中動脈阻閉前暴露雙側(cè)股動脈,大腦中動脈阻閉2h后實施再灌注前,立刻實施動脈夾夾閉雙側(cè)股動脈10分鐘,開放10分鐘,共3個循環(huán)；假手術(shù)組和模型組大鼠僅分離股動脈。分組由非手術(shù)者隨機分組。各組大鼠在再灌注24小時后,評價神經(jīng)功能評分；運用TIC染色法測定大鼠腦梗死的比例；運用干濕重比值法測量腦組織含水量；分別于光鏡和電鏡下觀察大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)病理損傷改變；運用TUNEL染色法評估海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況；運用SABC免疫組化染色方法評價海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)；運用RT-PCR法評價海馬CA1區(qū)IL-1βmRNA, IL-1Ra mRNA的半定量相對表達(dá)。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)記錄數(shù)據(jù)。不同組間比較用方差分析及q檢驗。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。P0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果 1、Sham-operated組大鼠無神經(jīng)功能障礙；與sham-operated組相比較,model組神經(jīng)功能缺損癥狀顯著,神經(jīng)功能評分顯著升高(P0.05)；與model組相比較,RIP組大鼠的神經(jīng)功能評分略有下降,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 2、RIP減輕MCAO/R后腦梗死體積：TTC染色可見sham-operated組大鼠腦組織呈紅色,未見梗死灶；model組大鼠腦組織腫脹明顯,缺血側(cè)發(fā)白,梗死范圍較大,累及皮質(zhì)、基底節(jié)和海馬等；而與model組相比較,RIP組大鼠梗死灶體積縮小。 3、RIP減輕MCAO/R后腦水腫：和sham-operated組相比,model組腦組織水腫明顯,含水量升高明顯(P0.05)：而與nodel組相比較,RIP組大鼠腦組織含水量顯著降低(P0.05) 4、HE染色光鏡觀察腦組織病理變化：sham-operated組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)正常,無水腫及壞死；model組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)呈明顯的病理性改變,間質(zhì)疏松、水腫,細(xì)胞周圍間隙增寬,細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)細(xì)胞體積縮��；RIP組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞濃縮和間質(zhì)腫脹程度明顯減輕,排列較規(guī)整。 5、電鏡觀察腦組織病理變化：sham-operated組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,胞膜完整,染色質(zhì)均勻分布于細(xì)胞核內(nèi),線粒體膜完整；nodel組細(xì)胞核中染色質(zhì)濃聚,線粒體明顯腫脹,呈空泡樣變,線粒體嵴皺縮或斷裂,甚至溶解,嚴(yán)重者線粒體內(nèi)外膜崩解；RIP組線粒體嵴排列欠規(guī)整,線粒體膜完整,線粒體結(jié)構(gòu)基本正常。 6、RIP減輕大鼠MCAO/R模型的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡：sham-operated組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)僅有極少的TUNEL染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞；model組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較sham-operated組明顯增多(P0.05),細(xì)胞核濃縮,呈棕褐色,且不規(guī)則；RIP組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)TUNEL染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比model組明顯減少(P0.05),凋亡率下降。 7、RIP減輕大鼠MCAO/R模型Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)：sham-operated組大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)僅有少量的Bcl-2和Bax免疫組化陽性細(xì)胞；model組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)免疫組化Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)、Bax陽性細(xì)胞數(shù)均比sham-operated組明顯增多(P0.05),但Bcl-2/Bax比值比sham-operated組降低(P0.05)；RIP組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)免疫組化Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)比sham-operated組和model組高(P0.05),Bax陽性細(xì)胞數(shù)高于sham-operated組(P0.05)但少于model組(P0.05),Bcl-2/Bax比值高于sham-operated組和model組(P0.05) 8、RT-PCR法檢測大鼠MCAO/R模型缺血側(cè)海馬CA1區(qū)IL-1β mRNA的表達(dá)：sham-operated組的IL-1β mRNA呈低水平表達(dá)；model組IL-1β mRNA的表達(dá)水平顯著較sham-operated組升高(P0.05)；RIP組IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯較model組下降(P0.05),但仍較sham-operated組升高(P0.05)。 9.RT-PCR法檢測大鼠MCAO/R模型缺血側(cè)海馬CA1區(qū)IL-1Ra mRNA的表達(dá)：sham-operated組IL-1Ra mRNA呈低水平表達(dá)；model組IL-1Ra mRNA的表達(dá)水平顯著較sham-operated組升高(P0.05)；RIP組IL-1Ra mRNA的表達(dá)水平較model組升高(P0.05)。結(jié)論 1、RIP可減輕MCAO/R后神經(jīng)功能缺損,減小梗死體積,減輕腦水腫,減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生腦保護(hù)作用。 2、IL-1β可促發(fā)MCAO/R后的炎癥反應(yīng)機制,而IL-1Ra可拮抗前者的作用,二者在CIRI中起重要作用。 3、RIP可通過下調(diào)IL-1p的表達(dá),同時使IL-1Ra表達(dá)上調(diào),減輕炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,減輕CIRI。 4、下肢作為后處理器官,安全、臨床可操作性強,值得臨床上進(jìn)一步探討并應(yīng)用。
[Abstract]:Purpose

緙鴻鎬ц剳琛，

本文編號：2106670