本文選題：維生素A + 視黃酸核受體α��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分孕期開始的VAD對成年仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能及組蛋白乙�；揎椀挠绊懩康模禾接憦脑衅陂_始的VAD對仔鼠成年期學(xué)習(xí)記憶功能及組蛋白乙�；揎椀挠绊�,以及RA信號通路與組蛋白乙�；揎椂叩穆�(lián)系。方法：建立從孕期開始VAD的大鼠模型,實(shí)時(shí)監(jiān)測VAN與VAD組仔鼠血清中VA濃度的變化；采用水迷宮行為學(xué)檢測VAN和VAD組實(shí)驗(yàn)大鼠在8W齡時(shí)的學(xué)習(xí)記憶功能；用real-time PCR 和 western blot技術(shù)分別檢測大鼠海馬區(qū)RARa的基因和蛋白表達(dá),同時(shí)用HAT活性檢測法檢測大鼠海馬區(qū)的HAT活性,western blot技術(shù)檢測乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達(dá),real-time PCR檢測學(xué)習(xí)記憶基因Zif268、 cFOS、FosB的基因表達(dá),CHIP-qPCR對Ac-H3、Ac-H4在兩組大鼠海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶基因啟動子區(qū)域的富集情況進(jìn)行檢測；進(jìn)而分別用real-time PCR 和 western blot技術(shù)檢測組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP、p300、 PCAF的基因和蛋白表達(dá)情況；最后用Co-IP和激光共聚焦技術(shù)對兩組大鼠海馬區(qū)RARa和CBP蛋白之間的相互作用情況進(jìn)行檢測。結(jié)果：(1)實(shí)時(shí)監(jiān)測VAN與VAD組仔鼠血清中視黃醇濃度的變化：可見VAD組血清VA濃度在生后1D、3D、7D、2W、4W、8W均明顯低于VAN對照組(p0.001),并在8W齡進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測：VAN組和VAD組大鼠均有學(xué)習(xí)記憶能力(p0.001),但從孕期開始的VAD大鼠在8W齡時(shí)學(xué)習(xí)能力明顯差于VAN組(p0.05)；(2)大鼠海馬區(qū)RARα的基因和蛋白表達(dá)：VAD組RARα表達(dá)較VAN組顯著降低(p0.01/0.001)； (3)大鼠海馬區(qū)HAT活性、乙�；M蛋白表達(dá)：VAD組大鼠海馬區(qū)的HAT活性、乙�；M蛋白表達(dá)顯著降低(p0.05/0.001)；大鼠海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶基因表達(dá)：VAD組大鼠海馬學(xué)習(xí)記憶基因(Zif268、cFOS、FosB)表達(dá)顯著降低(p0.01/0.05)；并且富集在記憶相關(guān)基因啟動子區(qū)域的乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4蛋白水平亦顯著降低(p0.01/0.05)； (4)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP、p300、PCAF)的基因和蛋白表達(dá)：VAD組CBP、p300的基因水平顯著低于VAN組(p0.01/0.05), PCAF在兩組間無顯著差異(p=ns)；CBP蛋白水平在VAD組表達(dá)顯著低于VAN組(p0.001),而p300、PCAF蛋白表達(dá)水平在兩組間沒有顯著差異(p=ns)； (5)海馬組織Co-IP和激光共聚焦檢測RARα與CBP蛋白兩者之間的相互作用：Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RARα與CBP蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用,并且這種相互作用在VAD組要顯著弱于VAN組(p0.001)；激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)VAD組的RARα與CBP蛋白在海馬三個(gè)分區(qū)(CA1、CA3、DG)的表達(dá)均要明顯弱于VAN組,兩者之間存在共表達(dá),并且這種共定位在VAD組也要顯著弱于VAN組(p0.001)。結(jié)論： (1)成功建立了從孕期開始的VAD大鼠模型,并確證了孕期開始的VAD會引起成年期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的障礙； (2)VAD時(shí)大鼠海馬區(qū)RARα的基因和蛋白表達(dá)顯著降低； (3)VAD嚴(yán)重影響了大鼠海馬HAT活性、乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá); (4)VAD時(shí)大鼠海馬區(qū)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP、p300、PCAF表達(dá)不同程度下降,其中CBP表達(dá)嚴(yán)重受損,VAD時(shí)HAT活性、Ac-H3、Ac-H4表達(dá)以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)的下降可能與CBP表達(dá)的下降密切相關(guān)； (5)VAD引起RA信號通路和組蛋白乙�；揎椀娘@著改變,大鼠海馬區(qū)RARα和CBP表達(dá)均顯著降低,二者之間存在相互作用,并且這種相互作用在VAD組也顯著低于VAN組。LARα口CBP相互作用異�？赡茉赩AD所致學(xué)習(xí)記憶功能障礙中起重要作用。第二部分 RARα介導(dǎo)的RA信號通路對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的CBP依賴性組蛋白乙酰化修飾作用的調(diào)控機(jī)制第一章 RARα對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的組蛋白乙�；揎椬饔玫恼{(diào)控機(jī)制目的：研究激活或抑制RARα介導(dǎo)的RA信號通路對CBP、HAT活性、乙�；M蛋白以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)胎鼠原代海馬神經(jīng)元,于培養(yǎng)的第六天用NSE做標(biāo)記對神經(jīng)元純度進(jìn)行鑒定。設(shè)定①RFP、②RFP+RA、③RA+siRARα、④ RA+Ad-RARa四個(gè)組,于培養(yǎng)的第六天,分別加入相應(yīng)的RA或RFP、siRARα、Ad-RARα的重組腺病毒進(jìn)行干預(yù),于培養(yǎng)的第七天采用Real-time PCR分別檢測RARα、CBP、記憶相關(guān)基因的RNA水平；CHIP-qPCR檢測四個(gè)組神經(jīng)元中RARα在CBP啟動子上的富集情況；于培養(yǎng)的第九天檢測各組的HAT活性,CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達(dá)。結(jié)果：(1)胎鼠原代海馬神經(jīng)元生長情況良好、胞體飽滿,突觸逐漸增長、形成相互連接,經(jīng)NSE免疫熒光鑒定,NSE陽性率90%,純度滿足實(shí)驗(yàn)要求；(2)經(jīng)RA處理后,RARa的基因和蛋白水平顯著增高,RA+siRARα腺病毒作用后的神經(jīng)元中RARα基因和蛋白表達(dá)水平顯著低于RFP+RA組,經(jīng)RA+Ad-RARα腺病毒處理后,RARα的mRNA和蛋白表達(dá)均達(dá)到最高,顯著高于RFP+RA組(p0.001/0.01);(3)CBP基因(p0.001/0.01/0.05)和蛋白表達(dá)、HAT活性(p0.001/0.01/0.05)、乙�；M蛋白Ac-H4表達(dá)、記憶相關(guān)基因表達(dá)在四個(gè)組的表達(dá)趨勢均同RARα的變化趨勢基本一致,即RFP+RA組的表達(dá)水平顯著高于RFP組與RA+siRARα組,而顯著低于RA+Ad-RARa腺病毒處理組； (4)RARα富集在CBP啟動子區(qū)域,并且富集的水平與RARα的表達(dá)趨勢基本一致(p0.001/0.01/0.05)。結(jié)論： (1)成功培養(yǎng)并鑒定了符合實(shí)驗(yàn)要求的胎鼠原代海馬神經(jīng)元 (2)獲得了滿足實(shí)驗(yàn)需求的相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)的RARα信號；(3)RARα能夠調(diào)控HAT活性、乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)； (4)RARα不僅能夠招募CBP成為輔激活子,還能直接調(diào)控CBP的表達(dá)水平,參與RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶基因的表達(dá)。第二章RARa介導(dǎo)的RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號中的CBP依賴性組蛋白乙�；揎棛C(jī)制目的：研究CBP信號對組蛋白乙酰化調(diào)控的特異性,以及其在RARa介導(dǎo)的RA信號通路調(diào)控學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號中的作用機(jī)制。方法：培養(yǎng)胎鼠原代海馬神經(jīng)元,于培養(yǎng)的第六天,設(shè)定(1)①NC、②siCBP兩組； (2)③Ad-RARa+NC、④Ad-RARa+siCBP/C646兩組； (3) ⑤RFP+NC、⑥RFP+RA+NC、⑦RFP+NC+siCBP三組。首先利用 (1) 中兩個(gè)組別對四種 siCBP慢病毒(GR805/GR806/GR807/GR808)進(jìn)行篩選和鑒定,選出具有最佳抑制效率和功能的siCBP慢病毒,然后在(2)、 (3)分組細(xì)胞中分別加入相應(yīng)的RA、腺病毒、慢病毒或抑制劑進(jìn)行干預(yù),于培養(yǎng)的第七天采用Real-time PCR分別檢測RARα、CBP、記憶相關(guān)基因的mRNA水平；于培養(yǎng)的第九天檢測各組的HAT活性,CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表達(dá)。結(jié)果： (1)四種siCBP慢病毒感染原代海馬神經(jīng)元后CBP mRNA和蛋白表達(dá)有不同程度降低,抑制效果最佳的GR806對神經(jīng)元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表達(dá)均有顯著抑制功能(p0.001/0.01/0.05)；(2)在用Ad-RARa將RA信號通路激活的基礎(chǔ)上,siCBP能夠特異性地將激活的CBP基因(p0.01)與蛋白表達(dá)顯著抑制下來,并且神經(jīng)元中HAT活性(p0.05)、乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4、記憶相關(guān)基因(p0.001/0.05)的表達(dá)亦均被顯著下調(diào)； (3)siCBP慢病毒作用于神經(jīng)元后,CBP的基因表達(dá)顯著降低(p0.05),而RARα的基因表達(dá)未發(fā)生顯著改變(p=ns)；CBP的抑制劑C646并沒有使RARI-的蛋白產(chǎn)生顯著下調(diào)； (4)用RA直接將RA信號通路激活后,CBP基因表達(dá)能被顯著上調(diào)(p0.05),在RA的基礎(chǔ)上siCBP作用后,上調(diào)的CBP表達(dá)又被顯著下調(diào)(p0.05),相應(yīng)地,下游乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4表達(dá)、記憶相關(guān)基因表達(dá)(p0.01/0.05)在三個(gè)組的表達(dá)趨勢均同CBP的變化趨勢基本一致。結(jié)論：(1)篩選并驗(yàn)證獲得了最佳抑制效率的siCBP慢病毒；(2)獲得了滿足實(shí)驗(yàn)需求的相應(yīng)變化的RARα、CBP信號 (3)CBP能夠特異性地調(diào)節(jié)神經(jīng)元中HAT活性、乙�；M蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)； (4)RARα在CBP的上游,RA信號通路對學(xué)習(xí)記憶相關(guān)信號的調(diào)節(jié)是通過RARα介導(dǎo)的CBP依賴性組蛋白乙�；揎椀恼{(diào)控實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:The effect of VAD on learning and memory function and histone acetylation in adult rats was investigated in the first part of pregnancy . The effects of VAD on adult learning and memory function and histone acetylation modification were discussed in the first part of pregnancy , and the relationship between RA signal pathway and histone acetylation modification was discussed .
The learning and memory function of the experimental rats at the age of 8 W was measured by the water maze behavioral study .
The gene and protein expression of RARa in rat hippocampus were detected by real - time PCR and western blot . The expression of Ac - H3 , Ac - H4 was detected by Western blot . The expression of Ac - H3 and Ac - H4 was detected by western blot .
Furthermore , real - time PCR and western blot were used to detect the gene and protein expression of histone acetyl transferase CBP , p300 and PCAF , respectively .
Results : ( 1 ) The changes of retinol concentration in serum of both groups of rat hippocampus were detected by co - IP and laser cofocus technique . Results : ( 1 ) The serum VA concentration in VAD group was significantly lower than that in control group ( p < 0.001 ) .
( 2 ) The gene and protein expression of RAR偽in hippocampus were significantly lower in VAD group than that in van group ( p0.01 / 0.001 ) .
( 3 ) In the hippocampus of rats , the expression of acetylated histone was significantly lower than that of VAD group ( p < 0.05 / 0.001 ) .
The expression of learning and memory genes in hippocampus was significantly lower in VAD group than in VAD group ( P 0.01 / 0.05 ) .
and the level of Ac - H3 and Ac - H4 protein enriched in the promoter region of the memory - related gene was also significantly reduced ( p0.01 / 0.05 ) ;
( 4 ) The gene and protein expression of histone acetyl transferase ( CBP , p300 , PCAF ) : The gene level of CBP and p300 in VAD group was significantly lower than that in the control group ( p0.01 / 0.05 ) , and there was no significant difference between the two groups ( p = ns ) .
The expression level of CBP protein was significantly lower in VAD group than that in control group ( p < 0.001 ) , while the expression level of p300 and PCAF was not significantly different between the two groups ( p = ns ) .
( 5 ) Co - IP and laser confocal microscopy showed that there was a protein - protein interaction between RAR偽and CBP protein .
Conclusion : ( 1 ) The VAD rat model started from pregnancy was successfully established , and it was confirmed that VAD induced by pregnancy could lead to the impairment of learning and memory function in adult rats .
( 2 ) The gene and protein expression of RAR偽in hippocampus were significantly decreased in VAD .
( 3 ) VAD significantly affects the expression of the activity , acetylated histones Ac - H3 , Ac - H4 and learning and memory - related genes in hippocampus of rats .
( 5 ) The effect of VAD on the expression of RAR偽and CBP in the hippocampus of rats was significantly decreased , and the expression of RAR偽and CBP was significantly lower in the hippocampus of rats .
The enrichment of RAR偽on CBP promoter was detected by CHIP - qPCR .
Results : ( 1 ) The growth of neurons in the primary hippocampal neurons of the fetal mice was good , the cells were full , the synaptic gradually increased , the formation of interconnection was formed , the positive rate of NSE was 90 % and the purity met the experimental requirements .
( 2 ) After RA treatment , RARa mRNA and protein level were significantly higher than that in RFP + RA group , and the expression of RAR偽mRNA and protein was highest after treatment with RA + Ad - RAR偽adenovirus , and the expression of RARa mRNA and protein was significantly higher than that in RFP + RA group ( p0.001 / 0.01 / 0.05 ) .
( 4 ) RAR偽was enriched in the promoter region of CBP , and the concentration of RAR偽was substantially identical to that of RAR偽( p0.001 / 0.01 / 0.05 ) . Conclusion : ( 1 ) Successful cultivation and identification of the primary hippocampal neurons ( 2 ) which meet the experimental requirements have obtained the corresponding up - regulated or down - regulated RAR偽signal that meets the experimental requirements ;
( 3 ) RAR偽was able to regulate the expression of the genes involved in the learning and memory related to the activity , histone Ac - H3 , Ac - H4 and downstream learning .
( 4 ) RARa can not only recruit CBP as a secondary activator , but also directly regulate the expression level of CBP and participate in the expression of learning and memory genes in the RA signal pathway .
( 2 ) ( 3 ) Ad - RARa + NC , ( 4 ) Ad - RARa + siCBP / C646 group ;
( 3 ) RFP + NC , ( 6 ) RFP + RA + NC , ( 7 ) RFP + NC + siCBP group .
Results : ( 1 ) The mRNA and protein expression of CBP , Ac - H3 , Ac - H4 decreased in different degrees after four siCBP slow virus infection in primary hippocampal neurons , and the best inhibitory effect of GR806 on the activity of the cells and the expression of Ac - H3 and Ac - H4 were significantly inhibited ( p0.001 / 0.01 / 0.05 ) .
( 2 ) On the basis of activation of RA signal pathway with Ad - RARa , siCBP could significantly inhibit the expression of active CBP gene ( p0.01 ) and protein expression , and the expression of CAP activity ( p0.01 ) , histone Ac - H3 , Ac - H4 and memory - related gene ( p0.001 / 0.05 ) in neurons were also significantly downregulated .
( 3 ) After the action of siCBP lentivirus on neurons , the gene expression of CBP decreased significantly ( p < 0.05 ) , while the gene expression of RAR偽did not change significantly ( p = ns ) ;
The inhibitor C646 of CBP did not significantly downregulate RARI - protein ;
( 4 ) After the RA signal pathway was directly activated by RA , the expression of CBP gene was significantly up - regulated ( p . 05 ) . After the action of siCBP on the basis of RA , the expression of the downstream acetylated histone Ac - H3 , Ac - H4 , and memory - related gene expression ( p0.01 / 0.05 ) were similar to that of CBP . Conclusion : ( 1 ) The siCBP lentivirus with the best inhibition efficiency was obtained and verified .
( 2 ) cbp signals ( 3 ) cbp which satisfy the corresponding changes of the experimental requirements can be obtained , and the cbp signals ( 3 ) cbp can specifically regulate the expression of hat activity , acetylated histones ac - H3 , Ac - H4 and downstream learning and memory related genes in the neurons ;
( 4 ) The regulation of RAR偽upstream of CBP and RA signal pathway to learning and memory related signals is realized by the regulation and regulation of CBP - dependent histone acetylation mediated by RAR偽.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741

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7 潘惠娟;行為訓(xùn)練對海馬梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及梗死灶周圍和顳葉皮層NR2B表達(dá)的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 王萍萍;蟲草頭孢菌對學(xué)習(xí)記憶功能的影響及作用機(jī)制的研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2013年

9 龔曉強(qiáng);補(bǔ)腎益氣化瘀方對亞急性衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2006年

10 崔曉榮;抗癡呆Ⅰ號對正常鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[D];吉林大學(xué);2012年

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本文編號：2082050