本文選題：Caspase-1抑制劑 + 白介素-1β��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：重癥肌無力(Myasthenia gravis, MG)是以損傷神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR)為特征,從而導致神經(jīng)肌肉處傳導功能障礙產(chǎn)生肌肉無力的自身免疫性疾病,這個過程是需要自身抗體介導,T細胞依賴,補體參與。為了更好地研究人類MG的發(fā)病機制及治療方法,從電鰩器官中提取AChR,通過皮下免疫Lewis大鼠能夠成功地建立實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)動物模型。進一步研究證實,人工合成的大鼠來源的AChR α亞基97-116肽段(R97-116)也可以起到類似作用,通過其皮下注射誘導的EAMG模型臨床評分、免疫學特征、電生理學指標及自身抗體水平與從電鰩器官中提取的AChR誘導的EAMG模型非常類似。樹突狀細胞(dendric cell, DC)、組織巨噬細胞、血液單核細胞等可以產(chǎn)生高效促炎因子IL-1β,這依賴于半胱氨酸天冬氨酸酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-1, caspase-1)的激活。Pro-IL-1β和pro-IL-18前體需要激活的caspase-1加工、剪接從而成為有活性的成熟形式,而caspase-1的活化需要炎性復合體(inflammasome)的分子復合物的參與。IL-1p和IL-18能夠誘導固有免疫細胞包括γδT細胞、NKT細胞分泌IL-17。成熟的IL-1p首先與固有免疫細胞表面的I型IL-1受體結(jié)合,然后與IL-1受體輔助蛋白結(jié)合形成受體復合物。Toll樣受體結(jié)構(gòu)域募集銜接分子MyD88,然后激活NF-κB,激活的NF-kB轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)并誘導促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄。IL-1靶向藥物,比如IL-1受體拮抗劑阿那白滯素、IL-1p單克隆中和抗體康納單抗,能夠快速、持久地抑制炎癥疾病。C57BL/6 EAMG大鼠每天注射IL-1受體拮抗劑可以通過減少血清IFN-7, TNF-a, IL-1β, C3, anti-AChR IgGl水平抑制EAMG臨床癥狀。最近研究發(fā)現(xiàn)caspase-1對固有免疫細胞的IL-17產(chǎn)生起著重要作用。Caspase-1在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)發(fā)病機制中的作用已經(jīng)闡明,在疾病的炎性過程中caspase-1蛋白水平和活性是上調(diào)的。Caspase-1基因敲除的小鼠EAE疾病發(fā)病率下降,這與Thl細胞受抑制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍炎性浸潤減少有關(guān)。在體內(nèi)實驗中,抑制caspase-1可以抑制Th17細胞和EAE的發(fā)生,注射IL-1p或者IL-18可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象,注射IL-1p效果更顯著。另外,一些研究已經(jīng)證實激活的caspase-1可以通過分泌IL-1p上調(diào)樹突狀細胞表面的N IHC class Ⅱ、CD80口CD86分子。我們由此推斷caspase-1是治療自身免疫疾病的重要藥物。在這個研究中,我們檢測了c aspase-1抑制劑對EAMG大鼠的影響,及其在內(nèi)源性樹突狀細胞、白介素-1、白介素-17途徑中的作用,為MG的治療提供了新的方向和思路。研究目的：探討caspase-1抑制劑影響實驗性自身免疫性重癥肌無力的細胞免疫學機制。研究方法：1.建立EAMG模型及臨床分級選擇健康的雌性Lewis大鼠,一般6-8周齡,體重160-180 g。用H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑溶解人工合成的大鼠來源的AChR α亞基97-116肽段(R97-116),首先每只大鼠在雙后足墊皮下注射免疫劑量200μl,然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次,作為強化免疫。每間隔一天采用Lennonl臨床評分量表對每只大鼠進行臨床分級和稱重,這個過程需要采用雙盲法。2.動物分組分別設(shè)立caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk治療組、caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk+IL-1β治療組和EAMG對照組。于第一次免疫后的第13天和第14天分別給予腹腔注射Ac-YVAD-cmk和IL-1β及等體積的滅菌PBS,觀察癥狀直至發(fā)病高峰期。3.制備脾臟、骨髓DC及檢測通過無菌操作分離、摘取Lewis大鼠的脾臟,在超凈臺中研磨脾臟組織,過濾、離心獲取單個核細胞懸液。用裂解液破壞細胞懸液中的紅細胞,離心、沖洗后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h 40 min,平晃培養(yǎng)瓶,使懸浮細胞離壁,棄掉其內(nèi)液體,沖洗并留取貼壁細胞,加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18h,最后懸浮的細胞即是脾臟樹突狀細胞。同樣的取Lewis大鼠的股骨和脛骨,制備單細胞懸液,加入10 ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培養(yǎng)8天后收集懸浮的樹突狀細胞。向培養(yǎng)瓶中加入LPS和Ac-YVAD-cmk(終濃度8μM),對照培養(yǎng)瓶中加入等體積的LPS和溶劑DMSO,培養(yǎng)48 h后收集懸浮的細胞。最后為了驗證Ac-YVAD-cmk對DCs作用,分別檢測兩組DCs表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達及其胞內(nèi)細胞因子IL-1p的水平。4.制備淋巴結(jié)單個核細胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠發(fā)病高峰期,無菌操作下分離、獲取各組大鼠腹股溝淋巴結(jié),通過研磨過濾、離心,制備MNC懸液,并用細胞計數(shù)板計數(shù),通過計算,最終獲取細胞濃度為2×106個細胞/ml的細胞懸液。5.通過流式細胞術(shù)檢測MNC細胞分群按細胞濃度調(diào)整每管淋巴結(jié)MNC細胞懸液1×106個細胞/管,洗滌細胞后分別加入PE標記的CD4抗體、PerCP標記的CD3抗體、PE標記的γδT抗體、PE標記的OX62抗體,然后用2%多聚甲醛4℃下孵育20 min,0.5%皂甙常溫孵育20 min,最后分別加入相應(yīng)FITC標記的IL-17抗體和FITC標記IL-1p抗體。檢測Treg細胞時,洗滌細胞后首先加入表面分子FITC標記的CD4抗體、PE標記的CD25抗體,在4℃下孵育30min。洗滌細胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)2 ml/管,4℃下避光孵育過夜。再次洗滌細胞后加入PE-Cy5標記的Foxp3抗體,在4℃下孵育30 min。Tfh細胞檢測加入PE標記的CD4抗體、FITC標記的CXCR5抗體和PE-Cy7標記的ICOS抗體,在4℃下孵育30 min。最后用400 ml PBS重新懸浮細胞,在流式細胞儀上進行檢測。6.通過CCK-8試驗檢測細胞增殖通過每組細胞計數(shù)結(jié)果,調(diào)整細胞濃度,取適量淋巴結(jié)MNC細胞懸液,種于96孔板內(nèi),均勻分組后每組分別加入ConA、R97-116、1640刺激。在37℃、5% CI2條件下培養(yǎng)72 h后,每孔吸取細胞上清液85μl保存在-20℃條件下,留作細胞因子檢測,然后向每孔中加入10μl CCK-8,在37℃、5% CO2條件下孵育4 h,通過酶標儀在450 nm波長下檢測其光密度值(OD值)。7.通過ELISA法檢測細胞上清液中的細胞因子含量取CCK-8試驗中R97-116刺激組淋巴結(jié)MNC細胞上清液,通過ELISA方法檢測細胞上清液中細胞因子IL-1β、IL-17的含量。8.通過ELISA法檢測血清中抗R97-116 IgG抗體水平和親和性在EAMG發(fā)病高峰期處死大鼠,吸取心臟血離心,獲取血清,通過ELISA法檢測不同組大鼠血清中抗R97-116 IgG抗體的水平和親和性。9.通過統(tǒng)計學分析各組大鼠數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0分析各組資料數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差(standard deviation, SD)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗,三組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA),當P0.05時,視為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果：1.體外試驗中兩組大鼠DCs表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子的表達情況在體外試驗中,與DMSO對照組相比,caspase-1抑制劑治療組脾臟DCs低表達CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子,而且caspase-1抑制劑治療組骨髓DCs低表達CD80、CD86和IL-1β分子。2.Caspase-1抑制劑可以緩解EAMG大鼠疾病進展并調(diào)節(jié)其DCs表面分子與EAMG對照組相比,caspase-1抑制劑治療組EAMG大鼠臨床癥狀明顯緩解。Caspase-1抑制劑治療對EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG抗體的水平無明顯影響,但是降低了抗R97-116 IgG抗體的親和性。經(jīng)流式檢測發(fā)現(xiàn),caspase-1抑制劑可以降低EAMG大鼠MNC中OX62+DC表面CD86、MHCⅡ分子的表達。3.外源性IL-1β對caspase-1抑制劑治療EAMG作用的影響與caspase-1抑制劑治療組大鼠相比較,caspase-1抑制劑+IL-1β治療組大鼠臨床癥狀明顯加重,而且caspase-1抑制劑+IL-1β治療組與EAMG組大鼠臨床癥狀無明顯差異。Caspase-1抑制劑+IL-1β治療組大鼠檢測血清抗R97-116 IgG抗體的水平顯著高于EAMG組和caspase-1抑制劑治療組,而且兩個治療組血清抗R97-116 IgG抗體的親和性均明顯低于EAMG組。另外,EAMG組和caspase-1抑制劑治療組血清抗R97-116IgG1、G2a、G2b抗體的水平無明顯差異,然而c aspase-1抑制劑+IL-1β治療組血清抗R97-116 IgG1、G2a水平明顯高于其他兩組。4. Caspase-1抑制劑治療EAMG通過抑制DC IL-1 p-CD4+T-γδT-IL-17途徑與EAMG對照組相比,caspase-1抑制劑治療組下調(diào)了OX62+DC細胞中IL-1β陽性細胞百分比,注射IL-1β僅能夠部分逆轉(zhuǎn)這個結(jié)果,caspase-1抑制劑+IL-1β治療組與EAMG對照組之間沒有明顯差異。與EAMG對照組相比,caspase-1抑制劑治療組減少了CD4+IL-17+細胞百分比,注射IL-1β可部分逆轉(zhuǎn)但沒有統(tǒng)計學差異。γδT細胞數(shù)量在三組之間沒有明顯差異。與EAMG對照組相比,caspase-1抑制劑治療組下調(diào)了γδT細胞中IL-17陽性細胞百分比,但是兩個治療組之間沒有明顯差異。與EAMG對照組相比,caspase-1抑制劑治療組降低了細胞培養(yǎng)上清中IL-1β水平,caspase-1抑制劑+IL-1β治療組IL-1β水平較caspase-1印制劑治療組上調(diào),但沒有達到統(tǒng)計學差異。細胞培養(yǎng)上清中IL-17水平三組之間沒有明顯差異。5. Caspase-1抑制劑對淋巴細胞增殖反應(yīng)和CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+CXCR5+ICOS+T細胞表達的影響結(jié)果顯示CD4+CD25+Foxp3+T百分比在三組之間沒有明顯差異。與EAMG對照組相比,caspase-1制劑治療組下調(diào)了CD4+CXCR5+ICOS+T細胞百分比,caspase-1抑制劑+IL-1β治療組與對照組之間沒有統(tǒng)計學差異。CCK-8增殖實驗顯示,在經(jīng)R97-116抗原刺激或者未經(jīng)R97-116抗原刺激后,caspase-1抑制劑治療組的淋巴細胞增殖反應(yīng)均較對照組明顯降低,兩治療組之間沒有明顯差異。結(jié)論：1.在體外實驗中,caspase-1抑制劑可以通過減少IL-1β水平降低DCs表面分子CD80、 CD86、MHC-Ⅱ表達抑制DCs成熟。2. Caspase-1抑制劑通過抑制DC IL-1 p-CD4+ T-γδT-IL-17途徑,降低抗R97-116 IgG抗體的親和性,從而抑制EAMG疾病發(fā)展。3. Caspase-1抑制劑可以減少CD4+CXCR5+ICOS+T細胞表達。4.注射外源性IL-1β并不能逆轉(zhuǎn)caspase-1抑制劑在EAMG中的作用。意義：本研究發(fā)現(xiàn)caspase-1抑制劑通過降低IL-1β水平抑制DCs成熟,減少了Tfh細胞數(shù)量,減少了CD4+T、γδT cells IL-17水平,降低了抗R97-116 IgG抗體的親和性,從而抑制EAMG疾病發(fā)展。注射外源性IL-1β并不能逆轉(zhuǎn)caspase-1抑制劑在EAMG中的作用。這為臨床上治療人類MG提供了一種新的思路和方法。研究背景：實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG),是研究人類重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)發(fā)病機制、治療方法的動物模型,可以通過皮下注射大鼠來源的AChR α亞基97-116肽段誘導。B細胞在二級淋巴器官淋巴小結(jié)的生發(fā)中心中經(jīng)過高頻突變、高親和力成熟,誘導漿細胞、記憶B細胞發(fā)育。分泌抗體的B細胞被公認為能夠促進免疫反應(yīng),在MG發(fā)病過程中起著重要作用。調(diào)節(jié)性B細胞在自身免疫疾病中的作用首先在實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EA E)中被報道。調(diào)節(jié)性B細胞(Breg)是具有特定功能的B細胞亞群,能夠負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性B細胞類似于調(diào)節(jié)性T細胞,可以分為分泌IL-10的B細胞(B10)、分泌TGF-β的B細胞、表達Foxp3的B細胞(B-Foxp3)。濾泡輔助T細胞,CD4+T細胞亞群,能夠在生發(fā)中心反應(yīng)中促進B細胞增殖、抗體親和力成熟。濾泡輔助T細胞以表面分子CXCR5 (CXC chemokine receptor 5)、ICOS (inducibleT-cell costimulator)、PD-1 (programmed death protein-1)為特征,其轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6 (B cell lymphoma 6)是濾泡輔助T細胞分化、發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。最近研究發(fā)現(xiàn)一部分的濾泡輔助T細胞同時表達Foxp3,被定義為濾泡輔助調(diào)節(jié)性T細胞,其能夠抑制濾泡輔助T細胞功能、生發(fā)中心反應(yīng)。之前的實驗主要研究caspase-1抑制劑在EAMG大鼠中對細胞免疫的影響,而本實驗進一步研究caspase-1抑制劑對體液免疫的影響。研究目的：探討caspase-1抑制劑治療實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的體液免疫機制。研究方法：1. EAMG模型的制備選擇健康的雌性Lewis大鼠,一般6-8周齡,體重160-180 g。用H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑溶解人工合成的大鼠來源的AChRa亞基97-116肽段(R97-116),首先每只大鼠在雙后足墊皮下注射免疫劑量200μl,然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次,作為強化免疫。2.動物分組分別設(shè)立EAMG對照組、caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk治療組,從第一次免疫后的第13天開始隔天給予腹腔注射Ac-YVAD-cmk,對照組給予等體積的滅菌PBS,觀察癥狀直至發(fā)病高峰期。3.通過ELISA法檢測血清中抗R97-116 IgG抗體水平和親和性在EAMG發(fā)病高峰期處死大鼠,吸取心臟血離心,獲取血清,通過ELISA法檢測不同組大鼠血清中抗R97-116 IgG抗體的水平和親和性。4.制備淋巴結(jié)單個核細胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠發(fā)病高峰期,無菌操作下分離、獲取各組大鼠腹股溝淋巴結(jié),通過研磨過濾、離心,制備MNC懸液,并用細胞計數(shù)板計數(shù),通過計算,最終獲取細胞濃度為2×106個細胞/m1的細胞懸液。5.通過流式細胞術(shù)檢測MNC細胞分群按細胞濃度調(diào)整每管淋巴結(jié)MNC細胞懸液1×106個細胞/管,洗滌細胞后分別加FITC標記的CD4抗體、PE標記的CXCR5抗體、PE-Cy7標記的ICOS抗體,4℃孵育抗體30min,洗滌細胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization) 2 ml/管,4℃孵育過夜。再次洗滌細胞后加入PE-Cy5標記的Foxp3抗體,在4℃下孵育30min。B10細胞檢測時洗滌細胞后先加入表面抗體FITC標記的CD19抗體,4℃孵育抗體60 min,然后用2%多聚甲醛4℃下孵育20 min,0.5%皂甙常溫孵育20 min,最后加入PE標記的IL-10抗體。檢測Breg細胞時,洗滌細胞后首先加入表面分子FITC標記的CD19抗體,在4℃下孵育抗體60min。洗滌細胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization) 2 ml/管,4℃下避光孵育過夜。再次洗滌細胞后加入PE標記的Foxp3抗體,在4℃下孵育30 min。最后過濾,用400 ml PBS重新懸浮細胞,在流式細胞儀上進行檢測。6.通過ELISA法檢測細胞上清液中的細胞因子含量取CCK-8試驗中R97-116刺激組淋巴結(jié)MNC細胞上清液,通過ELISA方法檢測細胞上清液中細胞因子IL-10的含量。7.通過免疫熒光檢測淋巴結(jié)生發(fā)中心用包埋劑將胭窩淋巴結(jié)包埋,切片后室溫晾干,放入4℃丙酮中固定10min。用0.5%BSA室溫封閉切片30min后洗滌切片,分別加入DyLight(?) 594標記的山羊抗大鼠IgM抗體、Fluorescein標記的PNA抗體,4℃孵育過夜。洗滌切片后,用熒光淬滅劑封片,在免疫熒光顯微鏡上觀察結(jié)果并拍照保存。8.通過統(tǒng)計學分析各組大鼠數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0分析各組資料數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差(standard deviation, SD)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗,當P0.05時,視為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果：1. Caspase-1抑制劑可以抑制EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗體、生發(fā)中心反應(yīng)在免疫后第43天,通過ELISA法檢測了對照組和治療組大鼠血清中抗體水平,兩組血清抗R97-116 IgG抗體水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異,但是治療組抗R97-116 IgG抗體親和性低于對照組。Caspase-1抑制劑治療組生發(fā)中心PNA+B細胞低于EAMG對照組。2. Caspase-1抑制劑平衡EAMG大鼠中Tfh、Tfr細胞亞群結(jié)果顯示,與對照組EAMG大鼠相比,caspase-1抑制劑治療組大鼠流式檢測Tfh細胞亞群減少,Tfr細胞亞群增加。3. Caspase-1抑制劑可以增加EAMG大鼠調(diào)節(jié)性B細胞數(shù)量結(jié)果顯示caspase-1抑制劑治療組大鼠B-Foxp3細胞數(shù)量較EAMG對照組增加,另外caspase-1抑制劑治療組大鼠B-10細胞數(shù)量也較對照組增加,但是沒有統(tǒng)計學差異。進一步檢測了經(jīng)R97-116抗原刺激細胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平,結(jié)果顯示caspase-1抑制劑治療組大鼠IL-10水平較對照組增加。結(jié)論：1. Caspase-1抑制劑治療可以降低EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗體親和性。2. Caspase-1抑制劑抑制生發(fā)中心反應(yīng)。3. Caspase-1抑制劑減少濾泡輔助T細胞數(shù)量,增加濾泡輔助調(diào)節(jié)性T細胞和調(diào)節(jié)性B細胞數(shù)量。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R746.1

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1 王聰聰;Gaspase-1抑制劑對實驗性自身免疫性重癥肌無力的影響與機制研究[D];山東大學;2016年

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本文編號：2052318