發(fā)布時(shí)間：2018-06-18 07:06

  本文選題：Sulfiredoxin1 + Peroxiredoxin(Prdxs)��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景：氧化應(yīng)激損傷是加重造成腦缺血/再灌注不可逆損傷的主要因素之一。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)維持細(xì)胞氧化/抗氧化平衡，抵抗腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的存活有至關(guān)重要的作用。Sulfiredoxin1(Srxn1)為一種小分子內(nèi)源性抗氧化蛋白，可以抵御細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，但其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及其具體的作用機(jī)制尚不清楚。 目的：構(gòu)建Srxn1干擾的體內(nèi)外模型，從細(xì)胞、動(dòng)物和分子水平上觀察并探討Srxn1在腦缺血再灌注損傷中的抗氧化保護(hù)作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法： （1）構(gòu)建四條Srxn1RNAi慢病毒載體，感染原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，用real-timeqPCR和Western Blot檢測(cè)干擾效率，篩選出最有效的病毒干擾片段。 （2）建立Srxn1基因干擾的原代神經(jīng)元氧糖剝奪（Oxygen-glucosedeprivation，OGD）模型，，采用MTS、LDH方法檢測(cè)細(xì)胞活性及細(xì)胞損傷程度，檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）的水平，分析細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)Srxn1的表達(dá)與Prdx1-4、Prdx-SO3之間的關(guān)系。 （3）構(gòu)建化學(xué)合成的Srxn1siRNA三條，一條陰性siRNA，于造模前24小時(shí)行側(cè)腦室注射，建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型（MCAO模型），用real-time qPCR和Western Blot檢測(cè)干擾效率，分別篩選出最有效的siRNA干擾片段。 （4）觀察Srxn1基因干擾對(duì)MCAO后大鼠的神經(jīng)學(xué)功能、梗死體積、形態(tài)學(xué)的影響，并通過(guò)測(cè)定腦組織勻漿SOD、MDA的水平，評(píng)價(jià)Srxn1在大鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)Srxn1的表達(dá)與Prdx1-4、Prdx-SO3之間的關(guān)系。 （5）構(gòu)建三條化學(xué)合成的Nrf2siRNA和一條陰性siRNA，造模前24小時(shí)行側(cè)腦室注射，建立MCAO模型，用real-time qPCR和Western Blot檢測(cè)干擾效率，篩選出最有效的siRNA干擾片段。檢測(cè)Nrf2基因干擾后NQO1的蛋白表達(dá)，以及Srxn1mRNA和蛋白的變化。 結(jié)果： （1）篩選出慢病毒GR545片段對(duì)神經(jīng)元Srxn1干擾效率最顯著。干擾Srxn1可降低OGD后神經(jīng)元的存活率，增加LDH的釋放，加重氧化應(yīng)激損傷。Western Blot分析顯示，干擾Srxn1可引起OGD后Prdx1-4蛋白表達(dá)降低，而Prdx-SO3表達(dá)升高。 （2）大鼠注射Srxn1siRNA并建立MCAO模型，篩選出Srxn1-631的干擾效率最顯著。干擾Srxn1明顯加重MCAO后大鼠神經(jīng)功能缺失，增大大鼠腦梗死體積，增加神經(jīng)元的損傷數(shù)目，加重氧化應(yīng)激損傷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示Srxn1干擾可引起MCAO后Prdx1-4表達(dá)降低，而Prdx-SO3表達(dá)升高。 （3）大鼠注射N(xiāo)rf2siRNA并建立MCAO模型，篩選出Nrf2-1008的干擾效率最顯著。干擾Nrf2基因表達(dá)可引起MCAO后NQO1蛋白表達(dá)減少，并導(dǎo)致Srxn1在mRNA和蛋白水平均降低。 結(jié)論： （1）缺血再灌注損傷可激活Srxn1的表達(dá)，干擾Srxn1則加重神經(jīng)組織的氧化應(yīng)激損傷。 （2）Srxn1可能作為Nrf2的下游基因，通過(guò)逆轉(zhuǎn)Prdx的過(guò)氧化，恢復(fù)Prdx的抗氧化活性，抵抗腦缺血再灌注損傷。
[Abstract]:Background: oxidative stress injury is one of the main factors that aggravate irreversible cerebral ischemia / reperfusion injury. In recent years, it has been found that endogenous antioxidant defense system can maintain oxidative / antioxidant balance of cells and resist oxidative stress of cerebral ischemia-reperfusion injury. Sulfiredoxin 1 (Srxn1) is a small molecule endogenous antioxidant protein that can resist oxidative stress injury of cells, but its role in the nervous system and its mechanism are not clear. Aim: to establish an in vitro and in vivo model of Srxn1 interference and to investigate the protective effect of Srxn1 on cerebral ischemia-reperfusion injury and its signal transduction mechanism at cellular, animal and molecular levels. Methods: four Srxn1RNAi vectors were constructed and infected with primary cultured cortical neurons. Cell morphology and transfection efficiency were observed under inverted fluorescence microscope. Interference efficiency was detected by real-time qPCR and Western blot. Screening out the most effective virus interference fragment. 2) to establish the primary neuronal oxygen glucose deprivation (Oxygen-glucose privation) model of Srxn1 gene interference, and to detect the cell activity and the degree of cell damage by MTS- LDH method. The levels of superoxide dismutase (SOD) and reduced glutathione (GSH) were detected, and the expression of Srxn1 and Prdx-SO3 were further detected by Western Blot. A negative siRNA was injected into the lateral ventricle 24 hours before the model. The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established in rats. The interference efficiency was detected by real-time qPCR and Western blot. The most effective siRNA interference fragments were screened respectively. (4) to observe the effects of Srxn1 gene interference on the neurological function, infarct volume and morphology of rats after MCAO, and to determine the level of MDA in brain homogenate. To evaluate the neuroprotective effect of Srxn1 on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Western Blot was used to detect the relationship between the expression of Srxn1 and Prdx1-4 Prdx-SO3. Three chemically synthesized Nrf2siRNA and one negative siRNA were constructed. Intracerebroventricular injection within hours, The real-time qPCR and Western Blot were used to detect the interference efficiency, and the most effective siRNA interference fragments were screened out. The protein expression of NQO1 and the changes of SrxN1 mRNA and protein were detected after Nrf2 gene interference. Results: lentivirus GR545 fragment had the most significant interference efficiency to neurons Srxn1. Interfering with Srxn1 decreased the survival rate of neurons, increased the release of LDH, and aggravated oxidative stress injury. Western blot analysis showed that interference of Srxn1 could decrease the expression of Prdx1-4 protein after OGD. However, Prdx-SO3 expression was increased. The interference efficiency of Srxn1-631 was obtained by injecting Srxn1siRNA and establishing MCAO model in rats. The disturbance of Srxn1 significantly aggravated the neurological deficit, increased the cerebral infarction volume, increased the number of neuron damage and aggravated oxidative stress injury in MCAO rats. In vivo experiments further showed that Srxn1 interference could induce the decrease of Prdx1-4 expression after MCAO, while the expression of Prdx-SO3 was increased. Nrf2siRNA was injected into rats and MCAO model was established. The interference efficiency of Nrf2-1008 was the most significant. Interfering with the expression of Nrf2 gene resulted in the decrease of NQO1 protein expression and the decrease of Srxn1 mRNA and protein level after MCAO. Conclusion: 1) Ischemia-reperfusion injury can activate the expression of Srxn1, and interfere with Srxn1 may aggravate oxidative stress injury in nerve tissue. It may be a downstream gene of Nrf2, and reverse the peroxidation of Prdx. To restore the antioxidant activity of Prdx and to resist cerebral ischemia reperfusion injury.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2034624