本文選題：腦缺血 + 凋亡��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型,也是成人死亡和殘疾的主要原因之一。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是一個(gè)涉及炎癥、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸中毒、細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜因素的級聯(lián)過程,這些因素相互影響,形成對腦組織的二次打擊,成為病情加重的主要原因。因此,若以上述級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為靶點(diǎn),抑制缺血半暗帶細(xì)胞的漸進(jìn)性死亡,可能發(fā)揮腦保護(hù)作用,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。瑞替加濱(retigabine,RTG)目前作為成人部分型癲癇發(fā)作的輔助用藥,具有穩(wěn)定神經(jīng)元靜息膜電位、抗興奮性等特點(diǎn)。除了作為新型抗癲癇藥物,瑞替加濱對神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性病變、肌張力障礙等疾病也具有潛在的臨床治療價(jià)值,同時(shí),在培養(yǎng)的海馬腦片上使用血清剝奪和血氧剝奪的方法,瑞替加濱可發(fā)揮抗氧化作用減少細(xì)胞的死亡。我們假設(shè)在缺血性腦卒中發(fā)生后瑞替加濱通過限制神經(jīng)元放電活動(dòng)保存細(xì)胞能量,減輕缺血情況下的腦損傷。缺血性腦組織死亡方式除了細(xì)胞壞死還包括細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后,損傷相對較輕的半暗帶區(qū)域的細(xì)胞可能經(jīng)歷著由基因調(diào)控的自主有序的死亡,即細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激損傷、過度炎癥反應(yīng)、谷氨酸大量釋放、鈣超載等均有可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號使細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”行為。凋亡的細(xì)胞在凋亡性核酸內(nèi)切酶的作用下細(xì)胞的DNA被降解,形成凋亡小體。研究表明,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)家族成員之一caspase-3是主要的凋亡“執(zhí)行者”,其活化后可以裂解多種功能蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后caspase在腦中的表達(dá)水平升高,抑制caspase的活化可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡的過程涉及到很多促凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及抗凋亡相關(guān)因子的抑制。缺血性腦卒中發(fā)生后,促凋亡蛋白Bax在腦中的表達(dá)水平升高。抑制Bax或過表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。鈣蛋白酶(calpain)是一類鈣依賴的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶的總稱,可以感受細(xì)胞內(nèi)升高的鈣離子濃度而被激活,并通過多種途徑引起細(xì)胞凋亡。calpain還可以裂解抗凋亡蛋白bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制calpain的活性也能發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究采用健康成年雄性cd-1小鼠為研究對象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型,給予瑞替加濱干預(yù)后,通過神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量測定,觀察瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠是否具有腦保護(hù)作用;通過測定小鼠缺血半暗帶細(xì)胞核dna斷裂的情況及cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織凋亡的影響;通過測定小鼠缺血后腦皮層bax、calpain-1及bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織中促凋亡、抗凋亡因子的影響,探討其可能的相關(guān)作用機(jī)制,為瑞替加濱的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三部分,各部分內(nèi)容概述如下。第一部分瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用目的:通過對瑞替加濱干預(yù)后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量測定,觀察瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用。方法:1采用健康成年雄性cd-1小鼠為研究對象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將cd-1小鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組(mcao)、瑞替加濱低劑量組(rtg5)、瑞替加濱中劑量組(rtg10)及瑞替加濱高劑量組(rtg20)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱低劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg;瑞替加濱中劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱高劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱15mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色測定腦梗死體積,干濕重法測定腦組織含水量。2為進(jìn)一步探討瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用時(shí)間窗,我們也觀察了在腦缺血發(fā)生后不同時(shí)間給予瑞替加濱干預(yù)對小鼠缺血性腦損傷的影響。將cd-1小鼠隨機(jī)分為5組:大腦中動(dòng)脈閉塞組(mcao)、瑞替加濱缺血后即刻用藥組(rtg-0h)、瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組(rtg-1h)、瑞替加濱缺血后2小時(shí)用藥組(rtg-2h)、瑞替加濱缺血后3小時(shí)用藥組(rtg-3h)。大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù);瑞替加濱缺血后即刻用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后即刻腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后2小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后2小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后3小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后3小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;各組小鼠在不需要瑞替加濱干預(yù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均腹腔注射等量的生理鹽水。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)ttc染色測定腦梗死體積。結(jié)果:1sham組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分均為0,mcao組小鼠則明顯高于sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg5組和rtg10組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);rtg15組小鼠神經(jīng)功能缺損評分較mcao組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2sham組小鼠腦片ttc染色后呈現(xiàn)均勻一致的紅色,mcao組小鼠腦片ttc染色后在右側(cè)皮層及基底節(jié)區(qū)呈現(xiàn)大范圍的白色梗死區(qū)域。與mcao組小鼠相比,rtg5組和rtg10組小鼠的梗死體積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);rtg15組小鼠的梗死體積較mcao組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3腦組織含水量測定結(jié)果顯示:與mcao組小鼠相比,rtg5組和rtg10組小鼠的腦組織含水量明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);rtg15組小鼠的腦組織含水量較mcao組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱給藥劑量在5mg/kg、10mg/kg時(shí)均能夠較好的發(fā)揮腦保護(hù)作用,接下來的實(shí)驗(yàn)我們將主要關(guān)注瑞替加濱在10mg/kg時(shí)的相關(guān)作用及機(jī)制。4與mcao組小鼠相比,rtg-0h組、rtg-1h組、rtg-2h組及rtg-3h組小鼠的梗死體積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。rtg-0h組、rtg-1h組、rtg-2h組及rtg-h3組小鼠的梗死體積相互比較沒有明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱10mg/kg在缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用。第二部分瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響目的:通過測定小鼠缺血后半暗帶腦細(xì)胞核dna斷裂的情況及cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。方法:采用健康成年雄性cd-1小鼠為研究對象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將cd-1小鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組(mcao)、瑞替加濱干預(yù)組(rtg)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)tunel試劑盒檢測半暗帶區(qū)域腦細(xì)胞核dna斷裂的情況,western-blot法檢測cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1與sham組相比,mcao組小鼠腦組織切片的tunel陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠腦組織切片的tunel陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于mcao組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2各組小鼠均有cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá);與sham組相比,mcao組小鼠的cleavedcaspase-3表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的cleavedcaspase-3表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。第三部分瑞替加濱下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織calpain-1、bax,上調(diào)bcl-2的表達(dá)目的:通過測定實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦皮層calpain-1、bax及bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對缺血腦細(xì)胞促凋亡、抗凋亡因子的影響,探討其抑制缺血性腦細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制。方法:采用健康成年雄性cd-1小鼠為研究對象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將cd-1小鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組(mcao)、瑞替加濱干預(yù)組(rtg)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)qrt-pcr檢測calpain-1、bax、bcl-2的mrna表達(dá)情況,western-blot法及免疫組織化學(xué)法檢測calpain-1、bax、bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1qrt-pcr結(jié)果顯示:與sham組相比,mcao組小鼠的calpain-1、bax的mrna表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的calpain-1、bax的mrna表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的bcl-2的mrna表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2western-blot結(jié)果顯示:各組小鼠均有calpain-1、bax、bcl-2蛋白的表達(dá)。與sham組相比,mcao組小鼠的calpain-1、bax蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的calpain-1、bax蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:各組小鼠均有calpain-1、bax、bcl-2陽性細(xì)胞。與sham組相比,mcao組小鼠的calpain-1、bax陽性細(xì)胞數(shù)升高;與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的calpain-1、bax陽性細(xì)胞數(shù)降低;與mcao組小鼠相比,rtg組小鼠的bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)升高。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)通過線栓法成功建立小鼠永久性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型,發(fā)現(xiàn)模型建立后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg、10mg/kg可以顯著降低小鼠的神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積,且以該劑量于局灶性腦缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究瑞替加濱腦保護(hù)作用的治療時(shí)間窗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2瑞替加濱干預(yù)可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù),抑制腦細(xì)胞核DNA的斷裂;還可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠cleaved caspase-3蛋白的表達(dá),抑制caspase-3的活化。從而抑制實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用。3瑞替加濱干預(yù)可以下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦細(xì)胞的calpain-1、Bax,上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平,從而抑制缺血性腦細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步提示瑞替加濱在腦缺血后可以發(fā)揮腦保護(hù)作用。
[Abstract]:Ischemic stroke is one of the most common types of stroke and is one of the main causes of death and disability in adults . Objective : To study the effect of retegaine on the brain protection of experimental cerebral infarction mice by means of the method of measuring bax , calpain - 1 and bcl - 2 in brain of mice .
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
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本文編號：2023235