本文選題：水通道蛋白4 + 視神經(jīng)脊髓炎��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO），又名Devic綜合征，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，，CNS）一種嚴(yán)重的特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾病，主要表現(xiàn)為單相或復(fù)發(fā)病程的視神經(jīng)炎和橫貫性脊髓炎。典型特征為病情反復(fù)發(fā)作，預(yù)后較差。NMO的發(fā)病機(jī)制尚不明確。在北美，非白種人口中NMO患者比例比經(jīng)典MS（multiple sclerosis，MS）患者的高。在亞洲，視神經(jīng)脊髓型MS是一種常見的炎性脫髓鞘疾病，在日本它大約占MS的5-40％。亞洲的視神經(jīng)脊髓型MS和西方的NMO是同一疾病實體嗎？很多呈現(xiàn)NMO初期癥狀的患者被誤診為MS，但這兩種疾病的預(yù)后和最佳治療方案不同。NMO的臨床表現(xiàn)較MS嚴(yán)重且預(yù)后差。第一次發(fā)病后的5年內(nèi)，約50％的患者需要協(xié)助行走，約62％的患者至少一只眼睛失去功能性視力甚至失明，約15-30％的患者死于高頸段脊髓炎誘發(fā)的呼吸衰竭和腦干參與的致命性自主神經(jīng)失調(diào)。免疫抑制藥物被認(rèn)為是NMO的最佳治療，而免疫調(diào)節(jié)藥物是目前推薦的用于早期MS的有效治療。直到NMO-IgG被發(fā)現(xiàn)，其靶抗原為CNS中的水通道蛋白4（AQP4）。AQP4自身抗體的檢測在NMO和MS的鑒別診斷中可能發(fā)揮重要作用，Wingerchuk新修訂的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)更把其作為支持診斷的一個重要指標(biāo)，但AQP4自身抗體檢測的低敏感性和特異性仍是待解決的重要問題。 本研究試圖構(gòu)建人AQP4的重組質(zhì)粒，并檢測其融合蛋白在人胚腎細(xì)胞系（HEK293）中的表達(dá)，為日后檢測NMO患者血清中的AQP4抗體提供一種高敏感性和特異性的實驗方法，初步將NMO和MS鑒別開來，使臨床治療更具有針對性和個體化，并可進(jìn)一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機(jī)制，為疾病活動、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供有意義的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。 方法： 1人AQP4基因的獲取 1.1引物設(shè)計合成：參照Genebank公布的人AQP4基因序列，分別設(shè)計其上下游引物，上游引物含NheⅠ酶切位點，下游引物含XhoⅠ酶切位點。以內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）作為陽性對照。 1.2腦組織中總RNA的提�。耗X組織取自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)患者，采用Trizol法提取其總RNA，提取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測定其純度和濃度。 1.3RT-PCR擴(kuò)增AQP4基因：利用隨機(jī)引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模版，利用AQP4特異性上下游引物將cDNA擴(kuò)增為DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定和純化。 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 AQP4亞型a和空質(zhì)粒pEGFP-N1分別以限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切過夜，鑒定酶切產(chǎn)物并回收純化。將酶切純化的AQP4和pEGFP-N1用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞--大腸桿菌DH5α，在硫酸卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)過夜，同時以轉(zhuǎn)化pEGFP-N1作為對照。挑取單克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組質(zhì)粒。 3重組質(zhì)粒的鑒定 3.1酶切鑒定：將獲得的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別進(jìn)行單酶切和雙酶切，所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后是否可切出完整AQP4基因。 3.2測序鑒定：將獲得的重組質(zhì)粒送上海生工測序，測序結(jié)果與GenBank中人AQP4序列進(jìn)行比對。 4細(xì)胞轉(zhuǎn)染、鑒定及篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 4.1HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前一天，將合適數(shù)量的細(xì)胞接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%細(xì)胞融合，通過Lipofectamine2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1為對照。 4.2檢測綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染處理組的GFP表達(dá)情況。 4.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選：轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24h后觀察瞬時轉(zhuǎn)染效率，同時將800mg/L的G418加入培養(yǎng)液，兩周后篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。聯(lián)合應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。 5鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 分別采用RT-PCR、Western Blot、間接免疫熒光法鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的基因和蛋白水平的表達(dá)情況，進(jìn)一步將固定的細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，確定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株融合蛋白是否具有膜定位效應(yīng)。 結(jié)果： 1RT-PCR擴(kuò)增人AQP4基因：RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖可見清晰的特異性擴(kuò)增條帶，與理論預(yù)期值相符。 2重組質(zhì)粒的鑒定：重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后在理論預(yù)期值處可見一特異性條帶，單酶切產(chǎn)物未見條帶；測序結(jié)果與理論序列符合率大于99%。 3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定及篩選：重組質(zhì)粒組可見GFP表達(dá)且熒光主要位于細(xì)胞膜上，空質(zhì)粒組可見GFP表達(dá)且熒光主要位于包漿中，未轉(zhuǎn)染處理組未見GFP表達(dá)；G418抗生素聯(lián)合流式細(xì)胞儀篩選使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。 4鑒定AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)： RT-PCR檢測AQP4的表達(dá)：RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，在972bp處可見一條特異性條帶； Western Blot檢測AQP4的表達(dá)：在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中提取的蛋白經(jīng)WB檢測分析，在61KD的位置出現(xiàn)特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞未見特異性條帶；間接免疫熒光法檢測AQP4的表達(dá)：熒光顯微鏡下觀察進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞，藍(lán)光激發(fā)時細(xì)胞表面呈綠色熒光，綠光激發(fā)時細(xì)胞表面呈現(xiàn)為紅色熒光，兩者于細(xì)胞膜位置重合良好；AQP4-GFP融合蛋白的細(xì)胞定位：激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光充滿整個細(xì)胞,無明顯局部定位；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光明顯定位于細(xì)胞膜區(qū)域。 結(jié)論： 成功克隆并構(gòu)建了pEGFP-N1-AQP4重組質(zhì)粒，并在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，為日后檢測NMO患者血清中的AQP4抗體提供了一種高敏感性和特異性的實驗方法，并可進(jìn)一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機(jī)制，為NMO疾病活動、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供有意義的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
[Abstract]:Objective : Neuromyenteric optica ( NMO ) , also known as Devic ' s syndrome , is a severe idiopathic inflammatory demyelinating disease in central nervous system ( CNS ) . It is characterized by recurrent onset of disease and poor prognosis . In Asia , the target antigen is the best treatment for early MS . In Asia , it is considered that the target antigen is the water channel protein 4 ( AQP4 ) in the CNS . The detection of AQP4 autoantibody may play an important role in differential diagnosis of NMO and MS . The low sensitivity and specificity of AQP4 autoantibody detection are still important issues to be resolved .

This study attempts to construct recombinant plasmid of human AQP4 , and to detect the expression of fusion protein in human embryonic kidney cell line ( HEK ) . To provide a high sensitivity and specificity for AQP4 antibody in serum of NMO patients , it is suggested that NMO and MS can be identified separately , which makes clinical treatment more targeted and individualized , and can further explore the possible pathogenesis of NMO . It provides a meaningful basis for predicting disease activity , recurrence and prognosis .

Method :

1 Human AQP4 gene acquisition

1.1 primer design and synthesis : referring to the human AQP4 gene sequence published by Genebank , respectively designing the upstream and downstream primers , the upstream primer containing the Nhe I cleavage site , the downstream primer containing the Xho I cleavage site , and using the internal reference beta - actin ( . beta . - actin ) as a positive control .

1.2 Extraction of total RNA from brain tissue : The brain tissue was taken from the second hospital neurosurgery patient of Hebei Medical University . The total RNA was extracted by Trizol method . The extracted product was identified by agarose gel electrophoresis and its purity and concentration were determined .

1 . The AQP4 gene was amplified by RT - PCR : the total RNA was reversely transcribed into cDNA by using random primers , the cDNA was used as a template , the cDNA was amplified into DNA by using an AQP4 specific upper and downstream primer , and the amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis analysis and identification and purification .

Construction of Recombinant Plasmid

The recombinant plasmid was purified by restriction endonuclease Nhe 鈪

本文編號：2013994