本文選題：姜黃素 + NK細(xì)胞　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：論文I姜黃素對實驗性自身免疫性重癥肌無力的治療研究研究背景及目的：重癥肌無力(Myasthenia gravis, MG)是一種經(jīng)典自身免疫性疾病,主要累及神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR),導(dǎo)致神經(jīng)肌肉處傳導(dǎo)功能障礙進(jìn)而產(chǎn)生肌肉無力,疾病過程需要AchR受體抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與。臨床上主要表現(xiàn)為部分或全身的骨骼肌易疲勞、波動性肌無力,活動后癥狀加重,經(jīng)休息或服用抗膽堿酯酶藥后癥狀可緩解。目前該疾病的治療方法多是應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)藥物,通常需要長期服用,且具有一定的副作用,這促使我們需要尋找一種毒副作用小且安全有效的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)從電鰩器官中提取AChR,通過皮下免疫Lewi s大鼠能夠成功地建立實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)動物模型。最新實驗研究,皮下注射大鼠來源的AChRα亞基97-116肽段(R97-116)也可以成功地誘導(dǎo)相似的抗原特異性免疫應(yīng)答模型,該肽段打破了抗原的耐受性,誘導(dǎo)T細(xì)胞自身活化及特異性抗體的產(chǎn)生。所以R97-116肽段誘導(dǎo)的EAMG模型常被用做研究與探討MG的理想動物模型。姜黃屬多年生草本植物姜黃的干燥梗莖,現(xiàn)代藥理分析其主要成分包含姜黃素(curcumin)、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素等,其中姜黃素是最重要的活性成分。姜黃素做為近年來的研究熱點,發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理作用,如抗癌作用、抗炎作用、抗氧化、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用、抗動脈粥樣硬化、降血脂功能等等。眾多研究已證實姜黃素對人類及動物免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)功能,例如：在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)中發(fā)現(xiàn),姜黃素能夠可以抑制TH1和TH17型細(xì)胞反應(yīng)并降低TNF-α的表達(dá)；在實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)中,姜黃素直接抑制CD4+T細(xì)胞中IFN-γ的分泌,減少了坐骨神經(jīng)中炎癥細(xì)胞的浸潤；在炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)研究中,發(fā)現(xiàn)中姜黃素可促進(jìn)Th細(xì)胞由Thl型向Th2型轉(zhuǎn)化。但到目前為止,還沒有關(guān)于姜黃素對于重癥肌無力疾病的相關(guān)報道,因此,我們在EAMG大鼠發(fā)病的起始階段給予姜黃素治療,探討其對EAMG大鼠的臨床癥狀、Th細(xì)胞分化、細(xì)胞因子、抗體水平、NK細(xì)胞、B10細(xì)胞的影響。研究目的：探討姜黃素對實驗性自身免疫性重癥肌無力的免疫調(diào)節(jié)作用。研究方法：1.建立EAMG模型及臨床分級選擇健康、SPF級別、雌性Lewis大鼠,一般6-8周齡,體重160-180 g。用H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑溶解人工合成的大鼠來源的AChR-α亞基97-116肽段合成免疫乳劑,每只大鼠在雙后足墊皮下注射200μ1乳劑,然后在免疫11天后于每只大鼠背部再次免疫1次,作為強(qiáng)化免疫。每間隔一天采用Lennon臨床評分量表對每只大鼠進(jìn)行臨床分級和稱重,直至發(fā)病高峰第45天,這個過程需要采用雙盲法。2. EAMG大鼠的分組與治療將18只Lewis大鼠每6只一組,隨機(jī)分成姜黃素小劑量治療組(50 mg/kg)和姜黃素大劑量治療組(100 mg/kg)和EAMG對照組(同體積PEG)。于EAMG大鼠發(fā)病第11日起開始,隔日給予姜黃素及等體積的PEG腹腔注射,直至大鼠發(fā)病高峰期第45天。3.制備淋巴結(jié)單個核細(xì)胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠發(fā)病高峰期,無菌操作下分離、獲取各組大鼠腹股溝淋巴結(jié),通過研磨過濾、離心,制備MNC懸液,并用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),通過計算,最終獲取細(xì)胞濃度為2×10。個細(xì)胞／ml的細(xì)胞懸液。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中的細(xì)胞因子取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液,加入細(xì)胞刺激阻斷劑,培養(yǎng)4h后收集細(xì)胞,標(biāo)記+IL-4+(Th2)、CD4+IL-17+(Thl7)和CD4+Foxp3+(Treg)細(xì)胞,及細(xì)胞因子TNF-α、IL-10,用流式細(xì)胞儀檢測。5.通過ELISA法檢測抗R97-116 IgG抗體水平和抗體親和力在EAMG發(fā)病高峰期處死大鼠,吸取心臟血靜置離心,獲取血清,通過ELISA法檢測不同組大鼠血清中抗R97-116 IgG抗體各亞型的水平和抗體親和力。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中的NKR-P1+細(xì)胞(natural killer cell receptor protein 1 positive cells)取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液,加入CD3、CD161抗體檢測NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測。7.檢測淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells, Breg)取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液,加入CD19、IL-10抗體檢測B10細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測。8.通過統(tǒng)計學(xué)分析各組大鼠數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0分析各組資料數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗,三組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)當(dāng)P0.05時,視差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：1.姜黃素可緩解EAMG大鼠的癥狀與未經(jīng)治療的EAMG對照組相比,姜黃素治療的EAMG大鼠臨床癥狀明顯緩解。與且EAMG對照組相比,大劑量姜黃素組在發(fā)病后第23天,27天,29天,33天,35天,37天,39天,41天,43天和45天均明顯減輕了大鼠的臨床癥狀。小劑量姜黃素組在發(fā)病后第29天,31天,43天and 45天與對照組相比明顯減輕了臨床癥狀。2.姜黃素抑制EAMG大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)與EAMG對照組相比,大劑量姜黃素治療組中大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD80及MHC-II的表達(dá)均顯著降低。兩組姜黃素治療組的淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD86的表達(dá)與EAMG對照組相比均明顯降低。3.姜黃素對EAMG大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中的CD4+IFN-γ+(Thl)細(xì)胞、CD4+IL-4+(Th2)細(xì)胞、CD4+IL-17+(Th17)細(xì)胞和CD4+Foxp3+(Treg)比例發(fā)現(xiàn),姜黃素治療后Th1、Th2、Th17、Treg的細(xì)胞比例有明顯變化,抑制了疾病的免疫進(jìn)展。另外,用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α、IL-10及1L-17細(xì)胞因子,與EAMG對照組相比,兩組姜黃素治療組大鼠MNC中的IFN-γ顯著降低,IL-10的表達(dá)明顯增加。小劑量姜黃素治療組與對照組相比,IL=17和TNF-α表達(dá)顯著下降；大劑量治療組的IL-17和TNF-α表達(dá)亦下降,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。4.姜黃素上調(diào)了淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中NK細(xì)胞與NKT細(xì)胞的數(shù)量姜黃素治療后,高劑量治療組的NK (CD3-CD161a+)細(xì)胞的數(shù)量與EAMG對照組相比明顯升高。與對照組相比,兩組姜黃素治療后NKT (CD3+CD161a+)細(xì)胞數(shù)量顯著升高。5.姜黃素的上調(diào)了淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中B10細(xì)胞的數(shù)量姜黃素治療后,與EAMG對照組相比,大劑量姜黃素治療組中B10 (CD19+IL10+)細(xì)胞數(shù)量顯著升高,小劑量姜黃素治療組B10細(xì)胞亦升高,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。6.姜黃素治療增加了抗R97-116抗體IgGl的表達(dá)并且降低了R97-116 IgG抗體的親和性與EAMG對照組相比,姜黃素治療后對EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG抗體的水平無明顯影響,但顯著降低了抗體的親和性。小劑量姜黃素治療組抗R97-116抗體IgG1的表達(dá)顯著增加,大劑量治療組抗R97-116抗體IgGl的表達(dá)也有升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：1.姜黃素治療有效緩解了EAMG大鼠的臨床癥狀。2.姜黃素治療抑制了EAMG大鼠T細(xì)胞表面共刺激因子CD80、 CD86和MHCclass-II的表達(dá)。3.姜黃素治療抑制了促炎細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生,上調(diào)了抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá),促進(jìn)Th細(xì)胞由Thl/Th17型向Th2/Treg型分化。4.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的數(shù)量。5.姜黃素治療促進(jìn)B細(xì)胞分化為B10細(xì)胞。6.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)保護(hù)性抗體IgGl的數(shù)量并且減少病理性抗體的總親和力。論文II新型煙堿對實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的治療研究研究背景及目的：格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病,可引起神經(jīng)肌肉麻痹,其中急性炎癥性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP)為最常見類型。AIDP是一種自身免疫性疾病,主要由CD4*T細(xì)胞介導(dǎo)、累及外周神經(jīng)系統(tǒng)(Peripheral nervous system, PNS)。實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(Experimental autoimmune neuritis, EAN)是目前公認(rèn)的研究人類格林巴利綜合征的理想動物模型,可通過免疫同種抗原(BPM、PO等)在易感動物中成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生。新型煙堿,一種與尼古丁化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似的煙草生物堿,半哀期比尼古丁長,但毒性與成癮性都遠(yuǎn)低于尼古丁,在許多疾病研究中顯示出優(yōu)秀的抗炎能力和治療效果,例如在阿茨海默癥中,新型煙堿能通過血腦屏障并抑制腦組織NF-kb通路活化；在實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動物模型中,新型煙堿抑制Thl/Thl7型細(xì)胞因子；在自身免疫性甲狀腺炎動物模型中,新型煙堿促進(jìn)Th2細(xì)胞因子分泌并減輕甲狀腺免疫球蛋白的抗體反應(yīng)。但至今還未有關(guān)于新型煙堿治療EAN或人類GBS的相關(guān)報道,因此,我們給予EAN大鼠新型煙堿治療,并研究其對大鼠自身免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型煙堿可以改善EAN疾病的臨床癥狀,減少了坐骨神經(jīng)炎性細(xì)胞的浸潤,下調(diào)了細(xì)胞因子IL-10與IFN-γ的表達(dá),上調(diào)了Treg細(xì)胞的表達(dá),增加的NK細(xì)胞的數(shù)量。綜上結(jié)果表明,新型煙堿有效的緩解了自身免疫性神經(jīng)炎模型大鼠的疾病癥狀,為治療格林-巴利綜合征提供了新選擇。研究方法：1.EAN模型的建立及臨床評分從新鮮牛尾中提取抗原BPM,采用健康、SPF級別、6-8周雌性lewis大鼠,150-170g,將BPM溶于H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全弗氏佐劑中,充分混勻制備成免疫溶劑。大鼠雙后足墊皮下注射免疫溶劑造模,每只大鼠用量為200μl。注射當(dāng)天定為第0天,雙盲法臨床評分,每日稱重,直至發(fā)病高峰第16天。2.動物分組及藥物干預(yù)將15只大鼠隨機(jī)分為三組,每組5只且體重平均數(shù)基本一致。三組分別為小劑量治療組(2 mg/kg)、大劑量治療組(20 mg/kg)和EAN對照組(同體積蒸餾水)。治療組于免疫后5第天開始用灌胃法給予新型煙堿藥物治療,直至免疫后第16天。對照組灌胃給予相同體積的蒸餾水。3.組織病理學(xué)檢測在發(fā)病高峰期水合氯醛麻醉后脫臼處死大鼠,取坐骨神經(jīng)置于10%多聚甲醛中固定,石蠟包埋后常規(guī)切片,然后依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、0.5%伊紅液染色、脫水、透明、封片等步驟處理。顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞的浸潤情況,并計數(shù)統(tǒng)計。4.制備淋巴結(jié)單個核細(xì)胞(mononuclear cells, MNC)無菌操作下分離大鼠腹股溝淋巴結(jié),用玻璃棒研磨、細(xì)胞濾器過濾、離心后制備單個核細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整獲得細(xì)胞濃度為2×10。個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。5.流式檢測Treg細(xì)胞的比例取調(diào)整好濃度的淋巴結(jié)MNC懸液,加入標(biāo)記的CD25抗體和CD4抗體,孵育30min后加入固定破膜工作液,避光孵育過夜,次日后洗滌細(xì)胞加入PE-cy5標(biāo)記的Foxp3抗體靜置30min后,重懇過濾細(xì)胞后上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測MNC的細(xì)胞因子取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備好淋巴結(jié)MNC懸液,經(jīng)過洗滌、固定、破膜后,加入細(xì)胞刺激阻斷劑,培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞,分別加入FITC標(biāo)記的IFN-γ、PE標(biāo)記的IL-10及FITC標(biāo)記的IL-17細(xì)胞因子,孵育、重懸、過濾后,用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。7.流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞取大鼠腹股溝淋巴結(jié)制備好的單細(xì)胞懸液,分別加入CD3、CD161抗體標(biāo)記檢測NK細(xì)胞,經(jīng)過孵育、重懸、過濾后,用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。8.通過統(tǒng)計學(xué)分析各組大鼠數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0分析各組資料數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)表示。兩組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗,三組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA),當(dāng)P0.05時,視為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：1.三組大鼠的發(fā)病癥狀與臨床評分三組老鼠均在第16天達(dá)到發(fā)病高峰,與對照組相比,兩組新型煙堿治療組大鼠的臨床癥狀明顯改善.與對照組相比,大劑量煙堿治療組的臨床評分從免疫后的第11天到16天均顯著降低。小劑量煙堿治療組的臨床評分也有降低,在免疫后第11天、第14天、第15天、第16天與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。兩組治療組間評分無明顯差異。2.新型煙堿治療減少了EAN大鼠坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸潤的情況與EAN對照組相比,大劑量煙堿治療組(20mg/kg)和小劑量煙堿治療組(2mg/kg)大鼠坐骨神經(jīng)均可見炎性細(xì)胞浸潤減少,且大劑量治療組與小劑量治療組相比可見更少的炎性細(xì)胞浸潤。3.新型煙堿抑制了EAN大鼠IL-10、IFN-y的表達(dá)用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中的IL-10、IFN-γ、IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)。與EAN對照組相比,兩組新型煙堿治療組的IL-10表達(dá)均下降,大劑量新型煙堿治療后細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)明顯下降,小劑量組IFN-γ表達(dá)亦下降但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組新型煙堿治療后IL-17表達(dá)均下降,但與對照組相比沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。4.新型煙堿治療上調(diào)了淋巴結(jié)惻C中Treg細(xì)胞的表達(dá)用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與EAN對照組相比,大劑量煙堿治療組上調(diào)了CD4+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量,小劑量煙堿治療組中CD4+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量亦上升,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。5.新型煙堿治療的增加了MNC中NK細(xì)胞的數(shù)量用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中NK細(xì)胞的表達(dá)情況。與EAN對照組相比,大劑量新型煙堿治療組CD3+CD161a+(NK)細(xì)胞數(shù)量增加,小劑量煙堿治療組中NK細(xì)胞有升高趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論和意義：本研究發(fā)現(xiàn),給予EAN大鼠新型煙堿治療后可有效緩解大鼠的臨床癥狀,藥物通過抑制坐骨神經(jīng)炎性細(xì)胞的浸潤,降低淋巴結(jié)MNC的CD80的表達(dá),上調(diào)淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的數(shù)量,抑制IL-10與IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá),增加的NK細(xì)胞數(shù)量幾個方面發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用,本實驗為臨床上治療人類GBS提供了一種新策略和新方法。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R746.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2013868