本文選題：神經(jīng)母細(xì)胞瘤 + MYCN擴(kuò)增��； 參考：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體ASCT2在MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)功能研究 背景和目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)是兒童中常發(fā)的實(shí)體腫瘤。約25%的腫瘤病患癌基因MYCN擴(kuò)增。MYCN擴(kuò)增的NB預(yù)后差,對(duì)常規(guī)化療藥物高度耐藥。目前尚無(wú)理想藥物有效治療癌患群體。進(jìn)一步深入研究此類腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的藥物靶點(diǎn),意義重大。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺成癮,需要大量外源性谷氨酰胺賴以存活。谷氨酰胺成癮使得MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞必須依賴活躍的轉(zhuǎn)運(yùn)體系補(bǔ)給生長(zhǎng)存活所需的谷氨酰胺。然而,MYCN擴(kuò)增的NB通過(guò)何種載體轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺及其確切的分子調(diào)控機(jī)制如何,目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)ASCT2(solute carrier family5, SLC1A5)是負(fù)責(zé)MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞中谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵載體。因此,這部分我們旨在深入研究ASCT2在MYCN擴(kuò)增的NB中的生物學(xué)功能,以期為抗癌藥物研發(fā)提供新的靶標(biāo)。 方法：MYYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞株Kelly. BE-2C和NLF作為體外細(xì)胞模型,采用細(xì)胞記數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,結(jié)晶紫染色檢測(cè)克隆形成,臺(tái)酚藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力,采用PI-Annexin V試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,BrdU法檢測(cè)細(xì)胞周期,氨基酸攝取實(shí)驗(yàn)測(cè)定[3H]-L-谷氨酰胺攝取率變化,代謝分析試劑盒檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平；采用RNA干擾抑制ASCT2基因表達(dá),熒光定量PCR法及Western-blot法檢驗(yàn)基因表達(dá)受抑制情況,同時(shí)Western-blot法檢測(cè)ASCT2沉默后p70S6K、p4E-BP1表達(dá)量的變化,采用裸鼠移植瘤模型,測(cè)量瘤重變化,通過(guò)免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中PCNA和c-Caspase-3的表達(dá)量的變化。 結(jié)果： 1.谷氨酰胺缺失細(xì)胞生長(zhǎng)和存活明顯抑制,克隆形成明顯減少,α-酮戊二酸(α-KG)或者非必需氨基酸(NEAA)能明顯的挽救谷氨酰胺剝奪引起的細(xì)胞死亡,但是并不能恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力,但同時(shí)補(bǔ)充α-KG和NEAA能完全恢復(fù)細(xì)胞的增； 2.天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺明顯抑制細(xì)胞的谷氨酰胺攝取,BCH、MeA1B、組氨酸對(duì)其攝取沒(méi)有影響,L-γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺(GPNA)濃度依賴性抑制谷氨酰胺攝��； 3.沉默三株細(xì)胞的ASCT2基因,谷氨酰胺的攝取率均下降50%以上,細(xì)胞體內(nèi)谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平明顯下降； 4.成功構(gòu)建ASCT2表達(dá)沉默的穩(wěn)定細(xì)胞系,ASCT2的mRNA和蛋白水平均顯著下降,其抑制率大于80%左右,ASCT2基因沉默三株細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯抑制,檢測(cè)kelly細(xì)胞的凋亡率,發(fā)現(xiàn)缺失40hr的細(xì)胞凋亡率增加了29.71%,G1期細(xì)胞比例明顯增大,S期細(xì)胞比例降低。ASCT2沉默后70S6、70S6K、4E-BP1的磷酸化水平明顯下降,表明ASCT2在nTORC1信號(hào)通路的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用； 5.穩(wěn)定敲除ASCT2的神經(jīng)母細(xì)胞瘤體生長(zhǎng)顯著緩慢于空載體對(duì)照組,其腫瘤組織中PCNA表達(dá)下降,c-Caspase-3升高,表明ASCT2沉默后通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促使凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。 結(jié)論： 1.MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞依賴提高的谷氨酰胺代謝維持細(xì)胞的增殖和存活； 2. ASCT2主要介導(dǎo)MYCN擴(kuò)增的NB的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)； 3. ASCT2對(duì)于MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路的激活和三羧酸循環(huán)的回補(bǔ)是必需的； 4. ASCT2功能缺失顯著抑制MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞增殖和存活,抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生,證實(shí)ASCT2在MYCN擴(kuò)增NB的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,我們的研究結(jié)果表明,ASCT2可作為治療MYCN擴(kuò)增的NB的潛在靶點(diǎn)。 第二部分N-Myc和ATF4對(duì)ASCT2勺調(diào)控機(jī)制及臨床意義的研究 背景和目的：我們?cè)诘谝徊糠盅芯恐凶C實(shí)ASCT2是維持MYCN擴(kuò)增的NB細(xì)胞谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子。然而其調(diào)控機(jī)制如何?我們發(fā)現(xiàn)MYCN高拷貝和高風(fēng)險(xiǎn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的ASCT2表達(dá)顯著增高,表明N-Myc可能調(diào)控ASCT2的表達(dá)。但癌基因MYC是調(diào)控腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)ASCT2的唯一關(guān)鍵因子嗎?通過(guò)信息生物學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)活化轉(zhuǎn)錄因子-4(ATF4)可能是參與ASCT2表達(dá)調(diào)控的另一關(guān)鍵因子。這些結(jié)果與臨床分期和預(yù)后是否存在相關(guān)性?因此這一部分我們將深入研究N-Myc和ATF4對(duì)ASCT2的調(diào)控作用機(jī)制及其臨床意義。 方法：熒光定量PCR法、Western-blot法檢測(cè)驗(yàn)證N-Myc,ATF4對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性ASCT2表達(dá)的影響和應(yīng)激狀態(tài)下ASCT2mRNA表達(dá)水平的變化,采用生物信息學(xué)方法分析ASCT2上的潛在結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建N-Myc, ATF4與ASCT2基因結(jié)合的潛在位點(diǎn)的野生型與突變型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性的變化,研究N-Myc, ATF4對(duì)ASCT2轉(zhuǎn)錄活性的影響,通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)研究N-Myc, ATF4與ASCT2DNA動(dòng)態(tài)的相互作用。通過(guò)NB的臨床樣本基因芯片(microarray)分析NB的ASCT2, MYCN和ATF4mRNA表達(dá),利用http://pob.abcc.ncifcrf. gov/cgi-bin/JK網(wǎng)站的NB基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的整合分析(Meta-Analysis)結(jié)果研究ASCT2與NB預(yù)后關(guān)系,采用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)NB病理組織切片中N-Myc,ATF4,ASCT2,PCNA蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.MYCN基因沉默時(shí),無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平,其ASCT2的表達(dá)量均會(huì)下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),N-Myc可直接結(jié)合在ASCT2啟動(dòng)子區(qū)域,在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)ASCT2的表達(dá)； 2.在葡萄糖、谷氨酰胺缺失和衣霉素(tunicamycin,Tm)作用下,ASCT2mRNA表達(dá)水平顯著升高,而低氧條件下ASCT2的表達(dá)沒(méi)有變化； 3.ATF4基因時(shí)沉默,當(dāng)谷氨酰胺缺失其ASCT2的表達(dá)不再呈升高趨勢(shì),與對(duì)照組在谷氨酰胺缺失時(shí)相比顯著下降(P0.001),ATF4蛋白在應(yīng)激和非應(yīng)激狀態(tài)下能夠與ASCT2的第一個(gè)內(nèi)含子上結(jié)合位點(diǎn)直接相互作用并激活其表達(dá)； 4.與MYCN單拷貝或者風(fēng)險(xiǎn)度較低的NB樣本相比,MYCN擴(kuò)增的高危組的腫瘤組織中的MYCN、ASCT2、ATF4mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著升高(P0.001)； 5. ASCT2基因表達(dá)高的病例在Kaplan-Meier生存曲線分析中顯示出較短的生存時(shí)間； 6. N-Myc、ATF4、ASCT2、PCNA在三例Ⅰ期分化程度比較好的NB組織中表達(dá)量都很低,而在13例分化差的樣品中其表達(dá)都較高。 結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子N-Myc直接激活A(yù)SCT2表達(dá),ATF4在應(yīng)激和非應(yīng)激狀態(tài)下均可直接激活A(yù)SCT2表達(dá)。N-Myc和ATF4共同參與ASCT2的調(diào)控促進(jìn)NB的惡性演化。ASCT2與NB的惡性程度以及不良預(yù)后呈顯著正相關(guān),表明ASCT2可作為臨床診斷和預(yù)后判斷的一個(gè)新的分子標(biāo)志物。
[Abstract]:Part I biological function of glutamine transporter ASCT2 in MYCN neuroblastoma
Background and objective: neuroblastoma (NB) is a common entity tumor in children. About 25% of the oncogene MYCN amplification by.MYCN is poor in the prognosis of NB, and is highly resistant to conventional chemotherapeutic drugs. The search for new drug targets is of great significance. Our previous study found that MYCN amplified NB cells were addicted to glutamine and needed a large number of exogenous glutamine to survive. The glutamine addiction made MYCN amplified NB cells depend on the active transport system to recharge the required glutamine for growth and survival. However, MYCN amplified NB passed. It is not clear which carrier to transport glutamine and its exact molecular regulation mechanism. This study found that ASCT2 (solute carrier family5, SLC1A5) is the key carrier of glutamine transport in MYCN amplified NB cells. Therefore, we aim to study the biological function of ASCT2 in MYCN amplification of NB, with a view to it. It provides a new target for the research and development of anticancer drugs.
Methods: MYYCN amplified NB cell line Kelly. BE-2C and NLF were used as cell model in vitro, cell growth was detected by cell number meter, crystal violet staining was used to detect clones, cell vitality was detected by trypan blue staining, cell apoptosis rate was detected by PI-Annexin V kit, cell cycle was detected by BrdU method, and [3H]-L was measured by amino acid uptake test. - the change of glutamine uptake rate, metabolic assay kit was used to detect the level of glutamic acid, succinic acid and fumaric acid in cells. RNA interference was used to inhibit ASCT2 gene expression, fluorescence quantitative PCR method and Western-blot method were used to test the inhibition of gene expression, and Western-blot method was used to detect the changes of p70S6K, p4E-BP1 expression after ASCT2 silencing. The tumor weight was measured by nude mice xenograft model, and the expression of PCNA and c-Caspase-3 in tumor tissues was detected by immunohistochemistry.
Result錛，

本文編號(hào)：1989989