本文選題：HIF-1α + 電針�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：隨著我國(guó)人口老齡化問題的日益嚴(yán)重，缺血性腦中風(fēng)的發(fā)生率日漸增加，但因?yàn)槿芩ㄋ幬锏闹委煏r(shí)間窗較窄及其副作用，僅有少部分患者接受溶栓治療，因而尋求更好的預(yù)防治療手段成為研究熱點(diǎn)。大量研究證實(shí)，電針預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)，減輕腦缺血損傷，但其腦保護(hù)的相關(guān)機(jī)制尚未得到完整闡明。 低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及微循環(huán)的重建等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，HIF-1α及其下游基因產(chǎn)物在腦缺血損傷中的保護(hù)作用已被廣泛關(guān)注，但其在電針預(yù)處理腦保護(hù)中的作用及上下游調(diào)控機(jī)制尚不清楚。 本課題應(yīng)用大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模擬局灶性腦缺血損傷，研究HIF-1α在電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血保護(hù)效應(yīng)中的作用及其機(jī)制，并對(duì)HIF-1α與Notch信號(hào)通路在腦缺血損傷中的相互作用關(guān)系進(jìn)行探討，以期闡明電針預(yù)處理的腦缺血保護(hù)機(jī)制，為電針預(yù)處理的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。 第一部分 觀察電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注前后HIF-1α的影響 目的： 1.研究缺血再灌注損傷對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響。 2.研究電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注前后HIF-1α表達(dá)的影響。 方法： 雄性SD大鼠96只，體重280~320g，，隨機(jī)分為兩組（n=48）：對(duì)照組（CON）和電針預(yù)處理組（EA），CON組動(dòng)物僅建立MCAO模型（n=40），EA組動(dòng)物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次電針刺激后24h建立MCAO模型（n=40），分別于最后一次電針刺激后24h和缺血再灌注后2h，6h，24h，48h及72h處死大鼠取缺血半暗帶腦組織（n=8），Realtime PCR(RT-PCR)檢測(cè)缺血半暗帶中HIF-1α及HO-1mRNA水平，Western Blot檢測(cè)缺血半暗帶中HIF-1α蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)染色定位觀察HIF-1α在腦內(nèi)細(xì)胞分布情況。 結(jié)果： 1. RT-PCR檢測(cè)顯示：缺血再灌注前，CON與EA組中HIF-1α及下游靶基因HO-1mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；缺血再灌注后，EA組HIF-1α及HO-1mRNA水平在再灌注后2h，6h及24h均顯著高于CON組(P0.05)，再灌注后48h及72h顯著低于CON組(P0.05)。 2. Western Blot檢測(cè)顯示：EA組HIF-1α蛋白表達(dá)在再灌注后2h較再灌注前顯著升高(P0.05，與缺血再灌注前比較)，并于再灌注后48h達(dá)到峰值，再灌注后2h，6h，24h及48h，EA組HIF-1α蛋白表達(dá)均顯著高于CON組(P0.05，與對(duì)照組比較)。 3.免疫熒光雙標(biāo)染色顯示：HIF-1α陽性信號(hào)與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN陽性信號(hào)存在共定位。缺血再灌注后24h，EA組HIF-1α陽性細(xì)胞及NeuN陽性細(xì)胞均顯著多于CON組(P0.05)，EA組缺血半暗帶中HIF-1α/NeuN雙標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量也顯著多于CON組(P0.05)。 結(jié)論： 電針預(yù)處理能顯著上調(diào)缺血再灌注后缺血半暗帶中HIF-1α表達(dá)，且HIF-1α表達(dá)于缺血后神經(jīng)元細(xì)胞之上。 第二部分 觀察抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血保護(hù)的影響 目的： 1.研究HIF-1α抑制劑2ME2對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血保護(hù)的影響。 2.探討HIF-1α在電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血保護(hù)中的作用機(jī)制。 方法： 雄性SD大鼠80只，體重280~320g，隨機(jī)分為五組（n=16）：假手術(shù)組（Sham），對(duì)照組(CON)，電針預(yù)處理組（EA），HIF-1α抑制劑組（2ME2）和電針預(yù)處理+HIF-1α抑制劑組（EA+2ME2）。Sham組動(dòng)物接受相同的手術(shù)操作，但不插入線栓阻閉大腦中動(dòng)脈；CON組，2ME2組，EA組及EA+2ME2組動(dòng)物均建立MCAO模型。EA組及EA+2ME2組動(dòng)物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；2ME2組及EA+2ME2組動(dòng)物分別于MCAO模型制備前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各組動(dòng)物處死（n=8），TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡，Western Blot檢測(cè)缺血半暗帶中Bcl2及Bax蛋白表達(dá)情況；缺血再灌注后72h，各組動(dòng)物（n=8）評(píng)估神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分后行MRI檢查，而后處死行TTC染色檢測(cè)腦梗死容積。 結(jié)果： 1.磁共振成像顯示：缺血再灌注后72h，Sham組大鼠T1及T2加權(quán)圖像均無腦梗死區(qū)顯像，T1加權(quán)圖像顯示腦梗死區(qū)效果不佳，EA組T2加權(quán)圖像中腦水腫程度顯著低于CON組（P0.05）。 2.神經(jīng)功能評(píng)分及TTC染色顯示：缺血再灌注后72h，與CON組比較，EA組神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善(P0.05)，而2ME2可以顯著降低EA+2ME2組神經(jīng)功能評(píng)分(P0.05)。CON組和2ME2組神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。腦梗死容積染色結(jié)果與神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果一致。 3. TUNEL染色顯示：缺血再灌注后24h，Sham組腦組織切片中未見TUNEL陽性細(xì)胞，而CON組和EA+2ME2組腦組織切片中TUNEL陽性細(xì)胞顯著多于EA組(P0.05)，CON組與2ME2組腦組織切片中TUNEL陽性細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。 4. Western Blot檢測(cè)顯示：缺血再灌注后24h，與EA組比較，CON組及EA+2ME2組中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05)；而CON組中Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05)。CON組與2ME2組中Bcl-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。 結(jié)論： HIF-1α抑制劑2ME2可以拮抗電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血保護(hù)作用，HIF-1α可能通過抑制缺血后神經(jīng)元凋亡，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血保護(hù)作用。 第三部分 研究腦缺血損傷中HIF-1α與Notch信號(hào)通路的相互作用關(guān)系 目的： 1.研究腦缺血損傷中HIF-1α與Notch信號(hào)通路的活化是否一致。 2.探討HIF-1α在電針預(yù)處理腦保護(hù)中的活化是否受Notch信號(hào)通路調(diào)控。 方法： 雄性SD大鼠32只，體重280~320g，隨機(jī)分為四組（n=8）：對(duì)照組(CON)，電針預(yù)處理組（EA），電針預(yù)處理+γ分泌酶抑制劑MW167組（EA+MW167）和電針預(yù)處理+HIF-1α抑制劑2ME2組（EA+2ME2）。四組動(dòng)物均建立MCAO模型；EA組，EA+MW167組及EA+2ME2組動(dòng)物接受連續(xù)5d電針刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；EA+MW167組動(dòng)物于MCAO模型制備前30min側(cè)腦室注射MW167（1mM，10μL）；EA+2ME2組動(dòng)物于MCAO模型制備前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各組動(dòng)物處死（n=8），免疫熒光雙標(biāo)染色定位觀察HIF-1α及NICD在腦內(nèi)細(xì)胞分布情況，Western Blot檢測(cè)缺血半暗帶中HIF-1α及Notch1NICD蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.免疫熒光雙標(biāo)染色顯示：HIF-1α陽性信號(hào)與NICD陽性信號(hào)存在共定位。缺血再灌注后24h，EA組缺血半暗帶中HIF-1α陽性細(xì)胞及NICD陽性細(xì)胞均顯著多于CON組(P0.05)，EA組缺血半暗帶中HIF-1α/NICD雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量也顯著多于CON組(P0.05)。 2. Western Blot檢測(cè)顯示：缺血再灌注后24h，與CON組比較，EA組缺血半暗帶中HIF-1α及NICD蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05)；γ分泌酶抑制劑MW167阻斷Notch通路激活后，EA+MW167組缺血半暗帶中HIF-1α及NICD蛋白表達(dá)均較EA組顯著降低(P0.05)；而HIF-1α抑制劑2ME2僅降低HIF-1α蛋白表達(dá)(P0.05，EA+2ME2與EA比較)，對(duì)NICD蛋白表達(dá)無顯著影響(P0.05，EA+2ME2與EA比較)。 結(jié)論： 腦缺血損傷后，HIF-1α與Notch信號(hào)通路同時(shí)活化；電針預(yù)處理可能通過激活Notch信號(hào)通路，上調(diào)HIF-1α表達(dá)，產(chǎn)生腦缺血保護(hù)作用。
[Abstract]:With the increasing problem of population aging in China, the incidence of ischemic stroke is increasing, but because of the narrower time window and side effects of thrombolytic drugs, only a few patients receive thrombolytic therapy, so the search for better preventive treatment has become a hot point. Cerebral ischemic tolerance can alleviate cerebral ischemia injury, but its mechanism of brain protection has not been fully elucidated.
Hypoxia inducible factor 1 alpha (hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1 a) plays an important role in the regulation of neuronal apoptosis and the reconstruction of microcirculation after ischemia. The protective effect of HIF-1 alpha and its downstream gene products on cerebral ischemia injury has been widely concerned, but its role in electroacupuncture preconditioning and the mechanism of upstream and downstream regulation and control It's not yet clear.
In this study, middle cerebral artery occlusion (MCAO) was used to simulate focal cerebral ischemia injury, and to study the role and mechanism of HIF-1 alpha in the protection of cerebral ischemia induced by electroacupuncture preconditioning, and to explore the interaction relationship between HIF-1 A and Notch signaling pathway in cerebral ischemia injury. The protective mechanism of ischemic preconditioning by electro acupuncture provides a new theoretical basis for the clinical application of electroacupuncture pretreatment.
Part one
To observe the effect of Electro Acupuncture Pretreatment on HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Objective:
1. to study the effect of ischemia-reperfusion injury on the expression of HIF-1 alpha.
2. to study the effect of electroacupuncture pretreatment on the expression of HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Method錛

本文編號(hào)：1982728