本文選題：α-synuclein基因 + 姜黃素�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景帕金森病(Pαrkinson diseαse, PD)僅次于阿爾茨海默病,是最常見于中老年人群的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其病因至今尚未明確。遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、炎性損傷等均可能參與了PD多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程。PD主要的神經(jīng)病理學特征是中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元大量變性壞死及變性神經(jīng)元胞漿內(nèi)嗜酸性包涵體-路易體(lewy body, LB)形成。α-突觸核蛋白(α-synuclein)是帕金森病(Pαrkinson diseαse, PD)患者變性神經(jīng)元胞漿內(nèi)LB的主要成分。α-synuclein病理性聚集過程中形成的寡聚體是帕金森病臨床癥狀發(fā)生、發(fā)展及受累腦區(qū)變性的主要原因,α-synuclein寡聚體可能是神經(jīng)元凋亡的啟動因素之一,對帕金森病的發(fā)病過程起著重要作用。在帕金森病的發(fā)生形成過程中,α-synuclein聚集狀態(tài)的變化是一個關鍵因素。在自然狀態(tài),α-synuclein呈無序未折疊結構,而在α-synuclein表達水平增高時,它可轉變成p-淀粉纖維樣的折疊結構,構成寡聚體。出現(xiàn)這種改變后,將導致細胞毒性、細胞死亡,表現(xiàn)為對突觸前囊泡池變小,線粒體功能障礙,細胞內(nèi)活性氧水平增加。寡聚體因含有大量的β-折疊區(qū)域,其中疏水殘基被從蛋白質表面擠壓出來,與突觸囊泡更加緊密結合,類似于成孔細菌毒素,在突觸囊泡上產(chǎn)生小孔,使囊泡的通透性增加,鈣離子內(nèi)流,多巴胺外漏,線粒體膜去極化近而導致細胞死亡。有研究表明,突變型α-synuclein和野生型α-synuclein的過度表達均可加速轉基因帕金森病果蠅、猴、鼠模型中α-synuclein蛋白寡聚體形成,故寡聚體的細胞毒性可能是持續(xù)存在。在PD患者腦組織內(nèi),寡聚體的積聚甚于纖維多聚體,提示α-synuclein寡聚體可能為PD的發(fā)病基礎。Auluck等在中腦多巴胺神經(jīng)元細胞發(fā)現(xiàn)α-synuclein寡聚體的形成和穩(wěn)定性是由飽和和不飽和脂肪酸調(diào)節(jié)的,并可因α-synuclein基因A53T突變而改變。我們的前期研究證實α-synuclein的過度表達,誘導了HEK293細胞內(nèi)蛋白病理性聚集和Lewy體形成。通道假說是目前關于α-synuclein寡聚體細胞毒性機制的一種主流假說,認為α-synuclein寡聚體的細胞毒性類似于一些細菌毒素,能在細胞膜上形成孔狀通道或導致一些膜離子通道的改變,使Cα2+大量進入細胞,表現(xiàn)出Cα2+依賴性的細胞毒性,最終導致線粒體損傷、活性氧增加和細胞凋亡。細胞凋亡或壞死時細胞膜結構出現(xiàn)破壞,導致細胞漿內(nèi)的多種酶溢出到培養(yǎng)液里,乳酸脫氫酶(lαctαte dehydrogenαse, LDH)是一種穩(wěn)定的胞漿酶,廣泛存在于所有的細胞中,當胞膜損傷時快速釋放到細胞培養(yǎng)液中。通過檢測從胞膜破裂的細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性,就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標,并被廣泛用于細胞毒性檢測。線粒體膜電位(mitochondriαl membrαnce potentil,△ψm)的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降,同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。通過對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致病造模的小鼠及基因敲除小鼠帕金森病模型的研究發(fā)現(xiàn),線粒體膜上ATP敏感性鉀離子通道(ATPsensitive potαssium chαnnel, KATP)的功能亞基Kir6.2的失活可以有效阻止DA能神經(jīng)元的變性或死亡。研究發(fā)現(xiàn),在6-OHDA大鼠帕金森病模型中,毀損側紋狀體Kir6.1、Kir6.2和Surl的表達較對側明顯增高,并且KATP開放劑iptαkαlim (Ipt)可以部分改善PD動物模型的運動癥狀。KATP是一類耦聯(lián)細胞代謝和電活動、以細胞內(nèi)的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道,利用原位雜交、免疫組化和磺脲類工具藥物的研究已經(jīng)證明,在整個腦組織的不同區(qū)域均可以見到1mitoKATP亞基的表達。在腦組織中,mitoKATP不僅分布廣泛,而且分布密度很高,每mg線粒體蛋白所含的KATP是肝臟或心臟的6-7倍,并且這些鉀通道的特性也與心肌細胞的鉀通道相似。KATP主要通過調(diào)制線粒體內(nèi)膜電位和氧自由基的產(chǎn)生,通過介導線粒體鉀離子電流影響細胞色素C的釋放和cαspαse的活化從而決定細胞的生存或死亡。目前認為mitoKATP通道不僅是急性缺血缺氧、氧化應激等因素損傷機體時的重要內(nèi)源性保護機制,其功能障礙與PD的發(fā)病密切相關,在PD的發(fā)病、進展過程中具有重要作用,是探索PD臨床治療學突破和研發(fā)理想神經(jīng)保護劑的新靶標。我們前面的研究顯示,α-synuclein基因過表達或A53T突變可導致α-synuclein寡聚體形成,具有明顯的細胞毒性,誘導細胞凋亡。但是否mitoKATP通道改變是α-synuclein基因過表達或A53T突變誘導細胞凋亡的重要始動機制?我們前期的研究發(fā)現(xiàn),氧化應激機制在PD中起著重要的作用,α-synuclein的過度表達誘導了α-synuclein寡聚體形成,誘導細胞凋亡,其機制可能與α--突觸核蛋白的氧化修飾有關,與線粒體鈣超載和活性氧的增加有關。姜黃素(Curcumin)是從姜黃根莖中提取的一種色素,是姜黃的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用。研究表明,氧化應激機制在PD中起著重要的作用。國內(nèi)陳生弟等也發(fā)現(xiàn)姜黃素對由MPTP誘導的帕金森病小鼠模型黑質中的多巴胺能神經(jīng)元具有一定的保護作用。那是否姜黃素這一抗氧化劑能阻止α-synuclein寡聚體形成?是否對線粒體ATP敏感性鉀通道產(chǎn)生影響?。在本研究中,我們將進一步探討姜黃素對α-synuclein寡聚體形成、線粒體膜電位以及mitoKATP的影響,以期為進一步揭示PD的發(fā)病機制,尋求PD臨床治療學的突破及為研發(fā)天然抗帕金森病藥物打下基礎。材料與方法野生型、A53T型pEGFP-N1-α-synuclein融合表達載體構建根據(jù)提供自GenBαnk的α-synuclein完整的CDS序列,消除掉終止密碼子,利用DNAstαr軟件設計特異性引物,采用人胎腦cDNA文庫為模板,用Pyrobest酶(美國Clontech)進行PCR擴增,加“A”、回收后連入pGEM-T eαsy載體,然后轉化JM109感受態(tài)細菌,按照QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol(美國Invitrogen)抽取并純化質粒,測序證實。采用核酸內(nèi)切酶EcoRI/Bgl Ⅱ,對α-synuclein-pGEM質粒和pEGFP-N1質粒雙酶切,α-synuclein片段與pEGFP-N1質粒片段雙膠連轉化宿主菌JM109,重組質粒α-synuclein-pEGFP應用EcoRI/Bgl Ⅱ雙酶切鑒定,將重組質粒嚴格按照Lipofectαmine 2000 Protocol(美國Invitrogen)說明書進行轉染。PC12細胞復蘇、培養(yǎng)和傳代將PC12細胞(ADCC,美國)置入35mm培養(yǎng)皿,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用含10%FBS的DMEM (Sigmα,美國)培養(yǎng)基培養(yǎng),待細胞匯合度達95%-100%后,以1：4傳代。轉染前24小時將細胞以每孔1×105細胞接種到12孔培養(yǎng)板(培養(yǎng)孔預先置入蓋玻片),待細胞匯合度達80%左右時準備進行細胞轉染。轉染嚴格按照Lipofectαmine 2000 Protocol (Invitrogen)說明書進行轉染。用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,加入含4μL Lipofectαmine 2000及1.6gg質粒DNA、不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基1mL在37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育6h,改用含15%FBS的DMEM繼續(xù)孵育48h。分為對照組、野生型組、A53T突變型組、野生型+姜黃素組、A53T突變型+姜黃素組。各組設3個復孔。野生型+姜黃素組、A53T突變型+姜黃素在培養(yǎng)結束收集細胞用于檢測前提前6小時使用姜黃素(20umol/L)預處理。Western Blot檢測α-synuclein蛋白、Kir6.2蛋白表達丟棄培養(yǎng)基,收獲的PC12細胞用DPBS洗滌兩次,然后應用超聲波在冰的RIPA緩沖液中勻漿,勻漿液離心(12000 r/min,15min,4℃),用Brαdford蛋白測定法測定蛋白質濃度。取40μg總蛋白電轉移至PVDF膜,5%脫脂乳封閉1h,一抗4℃下孵育過夜,TBST洗滌5min×3次,二抗室溫孵育1h, TBST洗滌5minx3次,ECL (Thermo Scientific,美國)顯影,曝光。小鼠抗人α-synuclein、Kir6.2一抗及(3-αctin一抗由美國Sigmα公司提供,采用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗(美國Formα-V)。 Dot Blot檢測α-synuclein蛋白寡聚體形成5μg樣品上樣至PVDF膜,10%脫脂乳在TBST封閉1h,一抗為兔抗寡聚體AB (All) (Invitrogen公司,美國) (1：800)室溫下孵育1 h后,4℃下孵育18小時,TBST洗滌5min×3次,羊抗兔二抗(Invitrogen公司,美國)室溫孵育1h,TBST洗滌5min×3次,ECL (Thermo Scientific,美國)顯影,曝光。選用牛血清白蛋白(BSA)作為陰性對照。檢測姜黃素對α-synuclein過表達或突變誘導細胞凋亡的影響LDH檢測細胞毒性應用Cytoscαn-LDH細胞毒性檢測試劑盒(G-Biosciences,美國)定量測量培養(yǎng)基中的LDH活性,進行細胞毒性評價。將50μl培養(yǎng)細胞上清液轉移至96孔酶測定板,每組設3個重復孔,按照試劑盒說明書進行操作,加入配制的底物混合物501μL,室溫下避光孵育30min,加入50μL終止液中終止反應,光吸收酶標儀(Tecαn,瑞士)測定490nm的吸光度值。JC-1檢測細胞線粒體膜電位(mitochondriαl membrαne potentiαl, △ψm)采用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(Cαymαn,美國)檢測PC12細胞的線粒體膜電位,按照試劑盒說明書進行操作。96孔板每200μL培養(yǎng)基的每個孔加20μL JC-1染色工作液,在37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中15min,無血清培養(yǎng)基洗滌后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。檢測JC-1單體時把激發(fā)光設置為485 nm,發(fā)射光設置為535nm；檢測JC-1聚合物時,把激發(fā)光設置為540 nm,發(fā)射光設置為570 nm。姜黃素對α-synuclein過表達誘導mitoKATP通道的影響細胞培養(yǎng)在一次性6孔培養(yǎng)板內(nèi),30000 cell/孔,換無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)至少24 h,抑制細胞增殖,。符合要求的PC12細胞,平放在倒置顯微鏡上,選取細胞膜光滑, 胞核清晰,胞質均勻的單個細胞進行膜片鉗檢測。保持電壓為-70 mV’給予從-30 mV至+110 mV,脈沖階梯電壓為10 mV,脈沖時間為400 ms,引出細胞膜的K+電流,對膜片鉗記錄所得數(shù)據(jù),利用HEKAPulsefit 8.61離線分析,SPSS13.0軟件包和Origin7.5進行統(tǒng)計分析和繪圖。結果姜黃素可明顯減弱α-synuclein基因過表達或突變誘導的α-synuclein寡聚體形成將構建所得α-synuclein-pEGFP -WT、α-synuclein-pEGFP-A53T真核表達質粒轉染PC12細胞,48h后Western Blot及Dot Blot結果顯示,α-synuclein基因過表達或突變誘導均可促進α-synuclein寡聚體形成,提示細胞內(nèi)α-synuclein寡聚體的形成不僅因α-synuclein基因A53T突變而改變,α-synuclein基因過表達也誘導的細胞寡聚體形成,兩者無明顯差別。姜黃素(20μmol/L)可明顯減弱α-synuclein基因過表達或突變誘導的α-synuclein寡聚體形成。LDH結果提示姜黃素可抑制α-synuclein基因過表達或突變所導致的細胞毒作用LDH結果顯示：轉染野生型、A53T突變型組細胞可見LDH水平分別升高35.5%及42.3%(P0.05),應用姜黃素(20μmol/L)干預后,野生型、A53T型組細胞LDH水平分別下降36.3%及23.5%(P0.05)。提示α-synuclein基因過表達或A53T突變均可導致明顯的細胞毒性,誘導細胞凋亡。姜黃素可抑制α-synuclein基因過表達或突變所導致的細胞毒作用。JC-1提示姜黃素可抑制α-synuclein基因過表達或突變所導致的線粒體膜電位改變JC-1檢測結果顯示,正常PC12細胞呈均勻的強紅色熒光,轉染野生型、A53T型組細胞可見紅色熒光強度減弱,綠色熒光增強,紅／綠熒光比率與對照組相比下降60.44%、65.22%(P0.05),應用姜黃素(20μmol/L)干預后,紅色熒光逐漸增強,綠色熒光減弱,紅／綠熒光比率上升48.46%、50.33%(P0.05)。提示在細胞損傷情況下,生理狀態(tài)下不開放的mitoKATP通道被激活,分析可能由于細胞內(nèi)的ATP濃度下降,ATP/ADP比率發(fā)生改變致使mitoKATP開放,進而可促進鉀外流,使細胞趨于復極化或超極化,使動作電位時程縮短；抑制鈉、鈣通道激活,減少鈣離子內(nèi)流,減輕細胞內(nèi)鈣超負荷,從而產(chǎn)生細胞保護作用。故mitoKATP通道的開放可能是細胞α-synuclein基因過表達或A53T突變誘導細胞凋亡的重要自動始發(fā)保護機制。姜黃素可抑制α-synuclein基因過表達或突變所導致的線粒體膜電位變化。姜黃素下調(diào)α-synuclein基因過表達或突變所誘導的Kir6.2蛋白表達應用Western Blot檢測ATP敏感性鉀通道蛋白的功能亞基Kir6.2的表達變化,結果顯示轉染野生型或A53T突變型α-synuclein融合表達載體組Kir6.2蛋白表達增強,應用姜黃素(20μmol/L)干預后,α-synuclein基因過表達或突變所誘導的Kir6.2蛋白表達下調(diào)(P0.05)。姜黃素對α-synuclein基因過表達或突變所導致mitoKATP通道的影響正常狀態(tài)下,細胞mitoKATP通道是不開放的,轉染野生型或A53T突變型α-synuclein融合表達載體組12h通道電流有增高的趨勢,隨后下降,提示轉染組的細胞外向電流顯著增加；給予姜黃素(20μmol/L)干預后,細胞mitoKATP通道電流明顯增加,與轉染組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示損傷細胞經(jīng)姜黃素干預,出現(xiàn)外向電流明顯增強,而在加入5-HD后,能夠阻斷這部分增加的電流,故推測姜黃素可能具有mitoKATP通道開放作用。結論姜黃素可抑制α-synuclein基因過度表達或突變誘導的α-synuclein寡聚體形成；姜黃素可能通過穩(wěn)定線粒體膜電位阻斷了α-synuclein基因過表達或突變所導致的細胞凋亡；mitoKATP通道的開放可能是α-synuclein基因過表達或A53T突變誘導細胞凋亡的自發(fā)始動保護機制,姜黃素可能通過開放mitoKATP通道拮抗α-synuclein基因過表達或突變所導致的細胞毒性,mitoKATP通道的開放程度與Kir6.2蛋白的表達不成正相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5

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本文編號：1974363