本文選題：芒果苷 + 腦缺血再灌注��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的 腦血管疾病是世界最常見的疾病之一,因其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類生命與健康。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)指供應(yīng)大腦血流的主要?jiǎng)用}發(fā)生狹窄或閉塞,結(jié)果導(dǎo)致腦組織(特別是大腦中動(dòng)脈區(qū)域)急劇缺血缺氧,最終引起局部腦組織發(fā)生缺血或壞死,出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀。缺血性腦卒中后可通過溶解血栓或機(jī)械再通的方式恢復(fù)缺血區(qū)的血液灌注,但一些病人在缺血后再灌注后不僅沒有使組織功能恢復(fù),反而使缺血所致的功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重,即我們所說的腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion (IR) injury)。腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,近來研究發(fā)現(xiàn),腦血流中斷和再灌注使腦的細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng),這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié),如能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果,彼此重疊,并相互聯(lián)系,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。目前雖然對(duì)腦缺血的病理生理機(jī)制研究取得重大進(jìn)展,但治療選擇仍然有限。一種成功搶救缺血組織的治療方式是恢復(fù)再灌注,溶解血栓的重組組織型纖溶酶原激活劑型(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)是唯一批準(zhǔn)臨床使用的藥物,然而其時(shí)間窗有限(3h-4.5h),且造成出血并加重缺血再灌注損傷的風(fēng)險(xiǎn)。另一種方法則是以缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)為靶點(diǎn),阻斷其發(fā)展,達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的目的。遺憾的是雖然目前許多神經(jīng)保護(hù)劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上能縮小腦梗塞體積并改善神經(jīng)功能,但沒有一種被證實(shí)臨床有效。 天然存在的抗氧化物質(zhì)所具有的神經(jīng)保護(hù)作用近來成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。芒果苷(mangineferin, MAG)是一種天然的多酚類物質(zhì),廣泛存在于許多藥材如百合科植物知母以及芒果葉中。芒果苷分子中的四個(gè)芳香族羥基使其具有較強(qiáng)的抗輻射以及抗氧化作用。大量已發(fā)表的體內(nèi)及體外研究表明芒果苷在炎癥、氧化應(yīng)激、腫瘤生長、微生物感染、代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)以及輻射保護(hù)方面具有廣泛的藥理學(xué)活性。 本研究通過在整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平上來建立神經(jīng)元缺血再灌注損傷模型,探討芒果苷對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制,從而為芒果苷更安全、合理的應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。 研究方法 在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,(1)采用線栓法阻塞大鼠中動(dòng)脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO),建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,觀察MAG對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,評(píng)價(jià)造模是否成功。大鼠腦缺血2h,再灌注24h后,觀察存活大鼠行為變化,參考Zea-longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。在劑量研究中,將大鼠隨機(jī)分成6組：模型組、假手術(shù)組、陽性對(duì)照組(edaravone, Eda)、MAG各劑量組(5mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。假手術(shù)組除不插線外,其余步驟同上。假手術(shù)組與模型組均給予等體積生理鹽水。HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變,觀察MAG對(duì)大鼠缺血大腦的梗塞面積及含水量的影響；(2)較長周期給藥實(shí)驗(yàn)中,將大鼠隨機(jī)分成6組：模型組、假手術(shù)組、陽性對(duì)照組、MAG的高、中、低各劑量組,造模成功后分別于第2、4、6、8d,稱量體重,采用姿勢(shì)反射試驗(yàn)、肢體不對(duì)稱試驗(yàn)兩種方法作為行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),觀察MAG對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)的影響；(3)氧化應(yīng)激生化指標(biāo)的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)大鼠分組同上。腦缺血2h,再灌注24h后,比色法檢測(cè)MAG對(duì)腦組織勻漿中丙二醛(malonaldehyde, MDA),還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的影響；(4)炎癥生化指標(biāo)的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)大鼠分組同上。RT-PCR檢測(cè)MAG對(duì)腦組織勻漿中炎性因子腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響,隨后實(shí)驗(yàn)采用ELISA法對(duì)上述兩種炎性因子在蛋白質(zhì)水平加以測(cè)定；(5)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞,應(yīng)用化學(xué)方法建立細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)損傷模型,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,并且應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法觀察不同濃度MAG對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響,測(cè)定細(xì)胞外液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)濃度。 研究結(jié)果 1.MAG對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)行為學(xué)的影響 假手術(shù)組大鼠均無異常癥狀,行為評(píng)分為0；模型組動(dòng)物出現(xiàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪,或向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒等的神經(jīng)損傷癥狀,其行為學(xué)評(píng)分與假手術(shù)模型組有顯著性差異(P=0.000)。芒果苷中劑量組、高劑量組與模型組相比可顯著降低行為學(xué)評(píng)分(P=0.023,P=0.030)。陽性對(duì)照組與模型組比較,行為學(xué)評(píng)分顯著改善(P=0.020)。而芒果苷低劑量組與模型組相比無顯著差異(P=0.818)。 2.MAG對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷大腦組織病理學(xué)的影響 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示：假手術(shù)組的大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,連接緊密。模型組的大鼠細(xì)胞周圍間隙增寬,神經(jīng)細(xì)胞大小不等,毛細(xì)血管萎縮,神經(jīng)細(xì)胞腫脹,排列紊亂,細(xì)胞核呈深染固縮,部分胞質(zhì)自溶,周圍出現(xiàn)較大空泡,缺血腦組織形態(tài)改變嚴(yán)重。各給藥組的大鼠均可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變減輕,細(xì)胞輕度腫脹,間質(zhì)較致密,壞死細(xì)胞數(shù)量減少。其中MAG高劑量組可見神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變明顯減輕,血管周圍間隙和神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬明顯減輕,優(yōu)于模型組,壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 3.MAG對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗塞體積及水腫的影響 圖像分析行MCAO術(shù)后的大鼠腦冠切面,與假手術(shù)組相比,經(jīng)TTC染色后可見明顯且可重復(fù)出現(xiàn)的腦梗塞。假手術(shù)組的腦組織無梗塞。芒果苷低劑量處理組與模型組比較,無顯著性差異(P=0.093),芒果苷中、高劑量組均可顯著縮小缺血側(cè)腦組織梗塞體積(P=0.001,P=0.000)。陽性對(duì)照組與模型組比較,腦梗塞體積顯著降低(P=0.001)。與假手術(shù)組比較(62.46±0.63%),腦缺血所致的腦含水量顯著增高(65.81±1.81%)說明了腦水腫的存在,模型組的腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組(P=0.000)；與模型組相比,芒果苷低、中、高劑量組(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)腦組織含水量顯著降低(P=0.006,P=0.000,P=0.000)。陽性對(duì)照組腦組織含水量顯著降低(P=0.000),與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.MAG對(duì)大鼠較長時(shí)間給藥后體重及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響 ①體重變化率：所有大鼠除假手術(shù)組外術(shù)后均體重下降。模型組由于缺血再灌注引起的損傷,造成體重呈下降趨勢(shì)。比較MCAO術(shù)后2、4、6、8d各組間體重變化率的差異,結(jié)果顯示與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)(1.49±8.70,4.61±7.55,7.54±6.83,11.65±6.99)比較,模型組MCAO術(shù)后第2d、4d、6d和8d體重變化率顯著降低(-10.36±2.55,-13.33±±6.05,-12.97±±7.61,-12.39±8.23),有顯著性差異(P均0.01)。與模型組比較,MAG高劑量組(20mg/kg)在造模后4、6d時(shí)可顯著改善缺血再灌注引起的體重下降(-5.34±10.30,-5.06±8.34),有顯著性差異(P均0.05)。MAG低、中劑量組(5、10mg/kg)及陽性對(duì)照組(6mg/kg)給藥后可改善缺血再灌注引起的體重下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.05)。 ②姿勢(shì)反射試驗(yàn)：假手術(shù)組大鼠肢體功能正常,評(píng)分為O。MCAO術(shù)后第2d、4d、6d和8d各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組(0±0)比較,模型組有顯著性增加(1.90±0.13,1.71±0.32,1.74±0.22,1.41±0.43),具有顯著性差異(P--0.000)。與模型組比較,芒果苷低劑量組(5mg/kg)各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異(P均0.05)外,中、高劑量組(10.20mg/kg)各時(shí)間點(diǎn)大鼠姿勢(shì)反射測(cè)量值均顯著下降(P均0.01)；與模型組比較,陽性對(duì)照組僅在2、6d兩個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠腦缺血引起的運(yùn)動(dòng)障礙有顯著的改善作用(P=0.000,P=0.000)。 ③肢體不對(duì)稱試驗(yàn)：與假手術(shù)組(18.08±17.50,0±23.98,5±27.76,13.46±21.25)比較,造模后第2d、4d、6d和8d各時(shí)間點(diǎn)模型組前肢不對(duì)稱應(yīng)用評(píng)分均顯著升高(68.89±21.33,52.78±33.36,48.89±35.16,52.78±30.01),具有顯著性差異(P=0.000)。比較MCAO術(shù)后2、4、6、8d時(shí)各組間肢體不對(duì)稱評(píng)分的差異,結(jié)果顯示與模型組比較,僅MAG高劑量(20mg/kg)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著下降(P均0.01)；芒果苷低、中劑量組(5、10mg/kg)和陽性對(duì)照組(6mg/kg)雖然在MCAO術(shù)后能改善在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肢體不對(duì)稱評(píng)分,但只有第2d和第8d有顯著意義(P均0.01)。 5.MAG對(duì)缺血再灌注大鼠腦SOD、GSH和MDA水平的影響 模型組腦缺血半球SOD活力顯著低于假手術(shù)組(P=0.007)；與模型組比較,MAG低、中、高劑量組(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)大腦SOD水平顯著高于模型組(P=0.050,P=0.011,P=0.001),表明芒果苷對(duì)腦缺血再灌注后腦組織SOD活力有一定恢復(fù)作用。陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組大腦SOD活力顯著高于模型組(P=0.014)。 模型組大腦GSH含量顯著低于假手術(shù)組(P=0.000)；與模型組比較,僅高劑量組(20mg/kg)腦組織GSH含量顯著高于模型組(P=0.002),低、中劑量組(5mg/kg、10mg/kg)則無顯著性差別(P=0.994,P=0.171)；陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組GSH含量顯著高于模型組(P=0.001)。 模型組大腦MDA含量與假手術(shù)組比較有顯著升高(P=0.000),表明缺血再灌注后腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強(qiáng)烈,伴有腦組織自由基的聚積以及抗氧化酶活性的降低；與模型組比較,MAG低、中、高劑量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)腦組織MDA含量顯著低于模型組(P=0.000,P=0.000,P=0.000),表明MAG對(duì)缺血再灌注后腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有顯著抑制作用。陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組MDA含量顯著低于模型組(P=0.000)。 6.MAG對(duì)缺血再灌注大鼠腦炎癥因子IL-1β,TNF-α的影響 定量RT-PCR分析顯示在假手術(shù)組中,腦組織IL-1βmRNA與TNF-α mRNA的表達(dá)較低,在缺血再灌注后均顯著上升。缺血2h,再灌注24h后,模型組缺血腦組織勻漿中IL-1β mRNA與TNF-α mRNA的表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組(P=0.004,P=0.000)。與模型組比較,芒果苷低、中、高劑量組顯著降低IL-1pmRNA的表達(dá)(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且呈一定劑量依賴性；與模型組比較,MAG低、中、高劑量組顯著降低TNF-α mRNA的表達(dá)(P=0.000,P=0.000,P=0.001)；陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉與模型組比較也顯著降低IL-1βmRNA與TNF-α mRNA的表達(dá)(P=0.001, P=0.000)。ELISA法在蛋白質(zhì)水平也證實(shí)了上述對(duì)炎癥因子的抑制作用。 7.MAG對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 正常對(duì)照組PC12細(xì)胞生長速度快,接種3d后,在倒置顯微鏡下可看到PC12細(xì)胞貼壁生長,形狀呈梭形、三角形,邊界清楚,胞漿豐富,突觸相互交織成網(wǎng)狀,折光性強(qiáng),呈典型的神經(jīng)元形態(tài)。模型組細(xì)胞折光度減弱,細(xì)胞圓縮、脫落。模型中PC12細(xì)胞的損傷及藥物保護(hù)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本一致,MAG各組和陽性對(duì)照組的細(xì)胞損傷程度均有所減輕,呈現(xiàn)一定的藥物形態(tài)保護(hù)。 8.MAG對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后細(xì)胞存活率及LDH漏出量的的影響 MAG低、中、高劑量組(5,10,20μM)及陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉(10μM)對(duì)氧糖剝奪模擬的缺血性損傷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。與正常對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P=0.000)。MAG各組呈劑量依賴性的提高細(xì)胞存活率,與模型組比較有顯著差異(P0.01)。與正常對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞LDH釋放量顯著增加(P0.01)；而MAG各組呈劑量依賴性減少LDH釋放量,與模型組比較有顯著差異(P0.01)。陽性對(duì)照組提高細(xì)胞存活率,降低LDH漏出量,與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論 MAG能夠在大鼠腦缺血再灌注后顯著升高腦組織中SOD活性和GSH含量,降低MDA含量,從而增強(qiáng)自由基清除能力,減輕脂質(zhì)過氧化損傷；降低腦組織中炎癥因子IL-1β mRNA與TNF-α mRNA基因的表達(dá),從蛋白質(zhì)水平也證實(shí)了對(duì)上述兩個(gè)炎癥因子的抑制作用,從而顯示其抗炎作用；同時(shí)MAG還能增強(qiáng)氧糖剝奪損傷后PC12細(xì)胞的存活力,降低細(xì)胞上清中LDH含量。這些可能是MAG能改善腦缺血后大腦的組織形態(tài)學(xué)變化,縮小腦梗死面積,減輕腦水腫損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),有效治療局灶性腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1956287