本文選題：缺氧缺血性腦損傷 + 缺氧誘導(dǎo)因子-1α��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景新生兒缺氧缺血性腦損(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指各種圍生期窒息而導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害,臨床出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn),至今仍是造成圍產(chǎn)期新生兒死亡和兒童傷殘的主要原因之一,但目前尚無理想的治療方法,因此迫切需要研究HIBD的損傷機(jī)制和尋找一種有效的治療策略。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)作為目前發(fā)現(xiàn)的具有高度特異性感受細(xì)胞氧分壓的調(diào)節(jié)因子,在缺氧腦損傷的病理生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用,參與細(xì)胞生存相關(guān)的細(xì)胞周期的穩(wěn)定及能量代謝,對缺氧缺血損傷后細(xì)胞的存活、凋亡、炎癥反應(yīng)、自噬激活、血管生成的調(diào)控等產(chǎn)生重要作用。但目前國內(nèi)外關(guān)于HIF-1α在HIBD早期的水平動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及其作用和機(jī)制的研究報(bào)道較少而且研究結(jié)論尚不一致。因此,本研究通過建立新生大鼠HIBD模型,觀察HIF-1α在HIBD早期的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,進(jìn)一步探討其可能的作用和機(jī)制,為臨床研究和治療新生兒HIBD尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論支持。研究目的本實(shí)驗(yàn)通過研究在新生大鼠HIBD早期腦組織中HIF-1αm RNA及其蛋白的表達(dá),觀察其水平時(shí)間依賴性的動(dòng)態(tài)變化,確定其表達(dá)水平最高的時(shí)間點(diǎn)。應(yīng)用HIF-1α抑制劑2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)抑制HIBD后HIF-1α表達(dá)上調(diào),觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變、腦組織含水量變化、細(xì)胞凋亡率及其下游促凋亡靶基因BNIP3的表達(dá)變化,探討HIF-1α在HIBD早期可能的作用和機(jī)制。研究方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組出生第一天為P0,日齡為P7的新生Sprague Dawley(SD)大鼠99只,雌雄不限,體重14.0~18.0 g,SPF級,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.將36只日齡為P7的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham,n=6)和模型組(HIBD,n=30),模型組根據(jù)處死大鼠時(shí)間的不同又分為5個(gè)亞組(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h組,n=6)。q RT-PCR、Western blot分別檢測Sham組及HIBD組不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1αm RNA及其蛋白的表達(dá)。2.將63只日齡為P7的SD大鼠隨機(jī)分為3組:Sham組(n=21),HIBD組(n=21),HIBD+2ME2組(n=21),依據(jù)實(shí)驗(yàn)1的q RT-PCR、Western blot結(jié)果,三組大鼠均在HIBD后24 h處死取腦,Western blot檢測HIF-1α和BNIP3蛋白的表達(dá),并進(jìn)行免疫熒光、HE染色、腦組織含水量、細(xì)胞凋亡率檢測。2模型建立及藥物干預(yù)參照經(jīng)典的Rice-Vannucci法制作新生大鼠HIBD模型:結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并在氮氧混合氣體(8%氧氣+92%氮?dú)?1.5 L/min)中缺氧2.5 h,每只大鼠的手術(shù)時(shí)間不超過5 min。Sham組僅游離左頸總動(dòng)脈,不予缺血缺氧處理。HIBD+2ME2組于模型制作后立即腹腔注射DMSO溶解PBS稀釋的2ME2(2ME2給藥劑量為15 mg/kg)。Sham組、HIBD組給予等量的DMSO和PBS。3標(biāo)本制備q RT-PCR及Western blot的標(biāo)本制備:10%的水合氯醛麻醉后,在冰板上迅速取出左側(cè)腦組織并分成2份標(biāo)本,分裝到無菌無酶的凍存管內(nèi),在液氮里速凍后即刻放入-80℃冰箱保存。石蠟切片標(biāo)本制備:各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛適度麻醉固定后,暴露胸腔進(jìn)行心臟灌注,先給予50 ml生理鹽水灌注,再給予50 ml 4%多聚甲醛灌注,取出整個(gè)腦組織后放入4%多聚甲醛固定液內(nèi)4℃固定24 h,選取視交叉到視丘間的腦組織,進(jìn)行脫水、石蠟包埋和切片,切片厚約3μm。再將切片脫蠟、水化,進(jìn)行免疫熒光、HE染色和TUNEL染色。4 q RT-PCR q RT-PCR檢測Sham組及HIBD組不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1αm RNA的表達(dá)變化。5 Western blot Western blot檢測Sham組及HIBD組不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白的表達(dá)變化;及2ME2干預(yù)后HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)變化。6 HE染色石蠟切片脫蠟水化后,經(jīng)蘇木素染色3~5 min,伊紅染色1~2 min,中性樹膠封片,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織病理形態(tài)學(xué)改變。7免疫熒光單標(biāo)免疫熒光檢測各組HIF-1α蛋白的分布與表達(dá)的變化。雙標(biāo)免疫熒光檢測HIF-1α在缺氧缺血腦組織中與BNIP3、Neu N是否共定位8腦組織含水量測定采用干濕重法測定腦組織含水量。HIBD后24 h 3組大鼠麻醉后處死,取出整個(gè)腦后迅速分為缺血同側(cè)腦半球、對側(cè)腦半球和小腦,稱量濕重并記錄,小腦做內(nèi)在參照,然后將腦標(biāo)本放入100℃的烤箱內(nèi)烘烤24 h至恒重,稱量干重并記錄。計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。9 TUNEL熒光染色HIBD后24 h進(jìn)行TUNEL熒光染色,按照原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)腦組織標(biāo)本取3張切片,每張切片隨機(jī)選取缺血側(cè)皮層的5個(gè)非重疊高倍鏡視野(×400),利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),計(jì)算凋亡率。10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s)表示,多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1 q RT-PCR結(jié)果Sham組HIF-1a m RNA低表達(dá),HIBD后6 h其表達(dá)水平迅速升高,24 h達(dá)頂峰(3.38±0.21),后逐漸下降,72 h降至(1.53±0.16);HIBD組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于Sham組(P0.01),且24 h組HIF-1αm RNA表達(dá)水平顯著高于其它時(shí)間點(diǎn)及Sham組(P0.05)。2 Western blot結(jié)果⑴Sham組HIF-1α蛋白低表達(dá),HIBD后6 h其表達(dá)水平逐漸升高,24 h達(dá)頂峰(2.81±0.36),后逐漸下降,72 h降至(1.37±0.19);HIBD組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白的表達(dá)水平均較Sham組高,且12 h、24 h、48 h組較Sham組顯著升高(P0.01),24 h組HIF-1α蛋白表達(dá)水平最高。⑵HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)水平在Sham組、HIBD組和HIBD+2ME2組3組間的比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與Sham組比較,HIBD組和HIBD+2ME2組HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與HIBD組比較,HIBD+2ME2組HIF-1α、BNIP3蛋白的表達(dá)水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 HE染色結(jié)果⑴Sham組:腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰,細(xì)胞排列整齊、形態(tài)正常、細(xì)胞核完整清楚,染色均勻。⑵HIBD組:腦組織結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)嚴(yán)重水腫,胞漿疏松、淡染,胞核固縮、碎裂、溶解、核仁消失,可見部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死,膠質(zhì)細(xì)胞相對增多,伴有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤,皮層及海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,尤以海馬區(qū)域更為明顯。⑶HIBD+2ME2組:腦組織結(jié)構(gòu)模糊,排列尚規(guī)則,間質(zhì)水腫,伴有少量炎性細(xì)胞浸潤,可見神經(jīng)細(xì)胞點(diǎn)狀變性、壞死,但是病變程度較HIBD組輕。4免疫熒光結(jié)果HIF-1α染色陽性細(xì)胞數(shù)/mm2在Sham組、HIBD組和HIBD+2ME2組3組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Sham組HIF-1α染色陽性細(xì)胞數(shù)/mm2較少且HIF-1α蛋白主要在胞漿中表達(dá),HIBD組HIF-1α染色陽性細(xì)胞數(shù)/mm2較Sham組明顯增多(P0.01)且主要在胞核中表達(dá),HIBD+2ME2組HIF-1α染色陽性細(xì)胞數(shù)/mm2較HIBD組明顯減少(P0.05)。HIF-1α免疫熒光染色與神經(jīng)元標(biāo)志物Neu N免疫熒光染色共定位,HIF-1α免疫熒光染色與BNIP3免疫熒光染色共定位。5腦組織含水量測定結(jié)果缺血同側(cè)半球腦組織含水量在Sham組、HIBD組和HIBD+2ME2組3組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行兩兩比較,與Sham組比較,HIBD組和HIBD+2ME2組腦組織含水量顯著增加(P0.01),與HIBD組比較,HIBD+2ME2干預(yù)組腦組織含水量顯著降低(P0.01);缺血對側(cè)半球三組間的比較(F=2.253,P=0.124)及小腦三組間的比較(F=2.173,P=0.133)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果細(xì)胞凋亡率在Sham組、HIBD組和HIBD+2ME2組3組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);兩兩比較發(fā)現(xiàn),HIBD組及HIBD+2ME2組細(xì)胞凋亡率與Sham組比較顯著增加(P0.01);與HIBD組比較,HIBD+2ME2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P0.01)。結(jié)論1 HIBD可激活HIF-1α在缺氧缺血腦組織中表達(dá),且HIF-1αm RNA及其蛋白表達(dá)水平均呈先升高后下降的趨勢,并于HIBD后24 h其m RNA和蛋白表達(dá)水平最高。2 HIBD后HIF-1α蛋白從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,并且其主要在缺氧缺血神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)。3在HIBD早期,伴隨HIF-1α、BNIP3表達(dá)上調(diào),腦組織病理形態(tài)、腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞凋亡加重;抑制HIF-1α的表達(dá),BNIP3的表達(dá)亦下降,缺氧缺血所致的腦損傷減輕。推測HIF-1α可能通過調(diào)控其下游促凋亡靶基因BNIP3的表達(dá)介導(dǎo)神經(jīng)損傷作用
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本文編號(hào)：1952994