發(fā)布時間：2018-05-29 16:51

  本文選題：膠質瘤 + 層粘連蛋白��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：神經(jīng)膠質瘤是臨床上最常見惡性原發(fā)性腦腫瘤,其發(fā)病率約占所有顱內原發(fā)性腦腫瘤的35.26～60.96%(平均44.69%)。通常,神經(jīng)膠質瘤中心是一個出血壞死灶,而周圍是與正常腦組織邊界不清的高致密腫瘤細胞區(qū)。神經(jīng)膠質瘤細胞具有無限增殖能力和很強的侵襲性,很容易向周圍正常腦組織進行侵襲。膠質瘤生長迅速且與周圍正常腦組織邊界不清,呈浸潤性生長,因此,神經(jīng)膠質瘤很難通過外科手術切除手段達到完全病理學腫瘤切除的目的。另外,由于神經(jīng)膠質瘤對放療不敏感和對化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性,也導致了其復發(fā)率高和預后差的結果。因而,盡管給予了多種綜合治療手段,神經(jīng)膠質瘤治療效果仍不理想,特別是惡性程度高的膠質母細胞瘤(GBM)患者生存期僅有12-15個月。惡性膠質瘤的難治性很大程度就在于其侵襲性強的生物學特性。因此,關于神經(jīng)膠質瘤侵襲性方面的研究和尋找更為有效的治療手段非常有必要。 通常,腫瘤基本的侵襲過程是瘤細胞從原發(fā)瘤灶脫落,侵襲基底膜(BM)和細胞外基質(ECM)相互作用的復雜過程。腫瘤細胞首先黏附于基底膜和血管內皮細胞,然后通過分泌蛋白水解酶和促進血管生成發(fā)揮作用。而所有級別的惡性膠質瘤都會發(fā)生彌漫性單細胞侵襲。膠質瘤細胞往往沿有髓纖維束和在血管周圍間隙沿血管進行遷移。因此,神經(jīng)膠質瘤這種侵襲特性與基底膜和細胞外基質的組成成分密不可分。多種基底膜和細胞外基質的組成成分已證實了在人膠質瘤中過度表達,如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白、玻連蛋白和腱糖蛋白,這些物質都與膠質瘤細胞的遷移和侵襲有著密切的聯(lián)系。 層粘連蛋白(laminin,LN)是一組細胞外基底膜異源三聚體的糖蛋白大家族,主要由α、β、γ這三種鏈不同的組合而構成。層粘連蛋白在許多基本的生物過程中發(fā)揮著重要作用,包括細胞粘附和遷移、胚胎發(fā)育、腫瘤浸潤、血管生成、組織分化和傷口愈合等。層粘連蛋白不僅是血管基底膜的主要功能成分,也是細胞外基質的主要功能成分。而且,層粘連蛋白還是正常腦組織微血管BMs的主要組成成分。膠質瘤細胞自身也能合成和分泌多種LN參與血管基底膜和血管基底膜構成,也表達大量的整合素受體。有研究發(fā)現(xiàn)在低級別和高級別的膠質瘤及膠質母細胞瘤(GBM)鄰近的正常腦組織中過度表達含α4鏈的LN。一種含α4鏈的LN亞型層粘連蛋白-8主要是在多形性膠質母細胞瘤和鄰近多形性膠質母細胞瘤的腦組織中的血管基底膜上表達,而另一個含α4鏈的層粘連蛋白-9則主要在低級別膠質瘤和正常組織血管基底膜表達。 LN-8是表達于血管內皮細胞的主要亞型。LN-8已被證實與相應的受體整合素結合,對于骨髓功能和血-腦屏障的維持起著十分重要的作用。LN-8還可以通過與整合素α3β1和α6β1的相互作用促進膠質瘤細胞黏附和遷移。過表達LN-8的GBM患者腫瘤復發(fā)時間和病人存活期與過表達LN-9的GBM患者相比較都有所縮短。而神經(jīng)膠質瘤一個顯著特征在于血管內皮細胞增殖和顯著的腫瘤血管生成,后者是膠質瘤的生長、侵襲和轉移過程中的一個重要的基礎條件。含α4鏈層粘連蛋白本身就能促進腫瘤血管生成。以上所訴說明了LN-8在膠質瘤的侵襲和腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著重要作用,可以促進膠質瘤的復發(fā)。隨著腦膠質瘤的進展,毛細管基底膜中含有α4鏈層粘連蛋白的表達會顯著上調,并且含有β2鏈的LN-9(α4β2β1)會被含有β1鏈的LN-8(α4βγ1)所取代。LN-8和LN-9具有相似的結構,只是其中的β鏈不同。膠質瘤進展過程中含β2鏈LN-9轉變?yōu)楹?鏈(LAMB1) LN-8潛在的調節(jié)因素還尚為人所知。因此,對于LN-8的基因調控機制的研究就顯得非常有意義。 MicroRNAs新近發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于真核生物體中內生的短鏈非編碼RNA,長約22nt(nt是核苷酸nucleotide的縮寫,lnt代表一個核苷酸單位)。MicroRNAs可以通過作用于相應靶基因調控細胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、侵襲和轉移,甚至還可以調節(jié)干細胞活化及新生血管生成。MicroRNAs基因通常位于在癌基因組的染色體脆性位點,被認為是一類新型的致癌基因和抑癌基因。在大多數(shù)實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)MicroRNAs表達水平的異常。這些異常表達的MicroRNAs還可以抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的遷移性、下調多種靶基因的表達等等。腦部腫瘤MicroRNAs表達譜的一系列的研究也發(fā)現(xiàn)一些MicroRNAs的表達異常。這些表達異常的MicroRNAs基因位點通常位于典型的腦腫瘤的上游或下游信號通路,能調節(jié)腦腫瘤細胞的致癌表型。 MicroRNA-124在各種哺乳動物的胚胎和成年皮質中大量表達,是一類腦組織中表達最為豐富特有的microRNA,約占腦組織microRNAs總量的25%～48%。MicroRNA-124對于維持正常的神經(jīng)發(fā)育和功能有著重要的作用。對神經(jīng)膠質瘤不同的表達譜的研究卻發(fā)現(xiàn)miR-124在惡性程度較高的間變性星形細胞瘤(Ⅲ級)和多形性膠質母細胞瘤(Ⅳ級)中的表達量是顯著下調的,提示miR-124的下調在神經(jīng)膠質瘤形成和進展過程中發(fā)揮著關鍵作用。miR-124在神經(jīng)膠質瘤中表達的恢復抑制了各種靶基因的表達,如lamininγ1和整合素β1,也抑制了腫瘤的轉移和侵襲,從而延緩腫瘤的進展。miR-124-3p(miR-124或者miR-124a)和miR-124-5p(miR-124*)都是miR-124的兩種成熟的形態(tài)(miR-124-5p在LAMB1的3'UTR一個公認的結合位點是由鳥嘌呤取代胞嘧啶而發(fā)生突變[星號標記])。miR-124-3p已證實在高級別膠質瘤中的表達是下調的,而且與膠質瘤患者預后相關。但是miR-124-5p在神經(jīng)膠質瘤中的表達是否和niR-124-3p的結果一致還是未知數(shù)。因此,篩選出miR-124在膠質瘤發(fā)展調控網(wǎng)絡中確切的靶標基因,對于膠質瘤的診療非常有意義。 基于我們先前研究觀察到GBM細胞系和組織中l(wèi)amininβ1蛋白的高表達和miR-124-5p的低表達與膠質瘤進展關系,我們設想這兩者之間在膠質瘤進展中是否存在相關關系。因此,本研究就針對miR-124-5p對lamininβ1的潛在調節(jié)機制進行探討。我們首先通過Q-PCR和Western Blot方法檢測GBM細胞系(U87和U251)及不同級別臨床膠質瘤標本中miR-124-5p與LAMB1之間的表達水平,利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)驗證miR-124-5p對LAMB1(蛋白質)表達的調控作用。通過體內、外研究對膠質瘤細胞系和組織中miR-124-5p的高表達和LAMB1的敲減對于細胞增殖、克隆形成、腫瘤生長和血管生成所產(chǎn)生的影響進行評估,驗證miR-124-5p對LAMB1潛在的調節(jié)作用。 第一部分各級別神經(jīng)膠質瘤層粘連蛋白-8和miR-124-5p的表達關系 目的：檢測層粘連蛋白-8LAMB1mRNA和蛋白,miR-124-5p在各級別神經(jīng)膠質瘤中的表達水平,并分析它們與神經(jīng)膠質瘤進展之間是否存在關聯(lián)。 方法：人U87和U251膠質瘤細胞系進行培養(yǎng)。于珠江醫(yī)院神經(jīng)外科和病理科各級別膠質瘤組織標本進行采集及處理。采用Q-PCR和Western blots檢測非腫瘤性腦組織、Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤、間變性星形細胞瘤(AAs, WHO Ⅲ級),多形性膠質瘤母細胞瘤(GBMWHOⅣ級)和U87、U251膠質瘤細胞系中的LAMB1mRNA和蛋白、miR-124-5p的表達水平。 結果：LAMB1mRNA和蛋白在AAs和GBM組織中的表達水平相比較于正常腦組織和Ⅰ/Ⅱ級神經(jīng)膠質瘤表現(xiàn)出顯著上調,膠質母細胞瘤組織中的LAMB1表達量最高。MiR-124-5p在間變性星形細胞瘤(AAs, WHO Ⅲ級)和多形性膠質母細胞瘤(GBM WHO Ⅳ級)的表達量與正常腦組織和Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤相比顯著下調。對miR-124-5P表達水平與LAMB1mRNA和蛋白表達水平進行秩相關分析：miR-124-5p表達水平與LAMB1mRNA和蛋白表達水平呈負相關關系。 結論：LAMB1mRNA和蛋白的表達水平隨著神經(jīng)膠質瘤級別和嚴重程度的增加而提高,而miR-124-5p表達水平隨著神經(jīng)膠質瘤級別和嚴重程度而下降,因此,miR-124-5p和LN-8可以作為神經(jīng)膠質瘤的生物標志物。下調的miR-124-5p和上調的LAMB1與膠質瘤進展相關,兩者之間呈負相關關系。 第二部分Has-miR-124-5p調控LAMB1基因的表達 目的：驗證miR-124-5p是否對LAMB1轉錄后水平具有調控作用。 方法：采用MicroCosm Targets Version5microRNA靶基因預測軟件in silico分析miR-124-5p在LAMB13'UTR端結合位點。MiR-124-5p minic、NC (miRNA minic negative control)、miR-124-5p inhibitor和miRNA NC inhibitor脂質體轉染U87和U251膠質瘤細胞,分別利用Q-PCR和Western blots檢測U87和U251膠質瘤細胞中LAMB1mRNA和蛋白水平。我們還利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)鑒定miR-124-5p對LAMB1(蛋白質)表達的調控作用。 結果：MicroRNA靶基因預測軟件in silico分析顯示miR-124-5p是LAMB13'UTR端結合位點。72小時后,轉染miR-124-5p minic過表達miR-124-5pU87和U251細胞的LAMB1蛋白水平相比于轉染NC的U87和U251細胞是下調的。轉染miR-124-5p inhibitor的U87和U251細胞的LAMB1蛋白水平相比于轉染NC inhibitor的U87和U251細胞是上調的。同時,LAMB1mRNA水平卻不受過表達或敲低miR-124-5p的影響。miR-124-5p對LAMB1基因的翻譯產(chǎn)生抑制作用。 結論：miR-124-5p對U87和U251膠質瘤細胞LAMB1mRNA的表達無調節(jié)作用,對U87和U251膠質瘤細胞LAMB1(蛋白)的轉錄后水平表達有直接的負調控作用。LAMB1是：miR-124-5p直接的靶基因。 第三部分MiR-124-5p表達恢復對異種移植膠質瘤腫瘤生長和微血管密度的抑制作用 目的：評估m(xù)iR-124-5p表達的恢復對于膠質瘤細胞增殖、細胞周期和遷移以及腫瘤生長和血管生成產(chǎn)生的影響。 方法：1.體外實驗：miR-124-5p minic和miRNA minic negative control (NC)脂質體轉染U87膠質瘤細胞。利用MTT實驗和Transwell細胞遷移實驗對轉染miR-124-5p minic和NC (miRNA minic negative control)的U87膠質瘤細胞的細胞增殖能力、細胞周期和細胞侵襲能力進行分析。2.體內實驗：建立免疫缺陷nu/nu裸鼠U87和U251皮下膠質瘤動物模型。當腫瘤體積達到150-200mm3,將小鼠隨機分配為2個處理組：miR-124-5p minic組和NC組(每組n=6),分別給予miR-124-5p minic和NC原位注射處理,監(jiān)測3個星期的腫瘤體積變化情況。利用Q-PCR, Western blots和免疫組化技術檢測各組腫瘤組織中LAMB1mRNA和蛋白水平變化；通過對腫瘤標本的腫瘤血管內皮標記物CD31行免疫組化分析腫瘤微血管密度的變化。 結果：miR-124-5p對U87膠質瘤細胞的細胞增殖能力、細胞周期和細胞侵襲能力無調控作用。miR-124-5p minic組的腫瘤生長與NC組相比是受到抑制的。miR-124-5p minic組的LAMB1蛋白水平與NC組相比較是下調的,而niR-124-5p minic組的LAMB1mRNA水平與NC組相比較無統(tǒng)計學意義。miR-124-5p minic組的腫瘤微血管密度與NC組相比較明顯下降。 結論：miR-124表達的恢復通過抑制LAMB1基因的蛋白表達導致膠質瘤腫瘤血管生成和腫瘤生長受到抑制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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6 劉U，

本文編號：1951666