本文選題：膠質(zhì)瘤 + 層粘連蛋白　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤是臨床上最常見惡性原發(fā)性腦腫瘤,其發(fā)病率約占所有顱內(nèi)原發(fā)性腦腫瘤的35.26～60.96%(平均44.69%)。通常,神經(jīng)膠質(zhì)瘤中心是一個出血壞死灶,而周圍是與正常腦組織邊界不清的高致密腫瘤細(xì)胞區(qū)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有無限增殖能力和很強(qiáng)的侵襲性,很容易向周圍正常腦組織進(jìn)行侵襲。膠質(zhì)瘤生長迅速且與周圍正常腦組織邊界不清,呈浸潤性生長,因此,神經(jīng)膠質(zhì)瘤很難通過外科手術(shù)切除手段達(dá)到完全病理學(xué)腫瘤切除的目的。另外,由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤對放療不敏感和對化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性,也導(dǎo)致了其復(fù)發(fā)率高和預(yù)后差的結(jié)果。因而,盡管給予了多種綜合治療手段,神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療效果仍不理想,特別是惡性程度高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者生存期僅有12-15個月。惡性膠質(zhì)瘤的難治性很大程度就在于其侵襲性強(qiáng)的生物學(xué)特性。因此,關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲性方面的研究和尋找更為有效的治療手段非常有必要。 通常,腫瘤基本的侵襲過程是瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤灶脫落,侵襲基底膜(BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相互作用的復(fù)雜過程。腫瘤細(xì)胞首先黏附于基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞,然后通過分泌蛋白水解酶和促進(jìn)血管生成發(fā)揮作用。而所有級別的惡性膠質(zhì)瘤都會發(fā)生彌漫性單細(xì)胞侵襲。膠質(zhì)瘤細(xì)胞往往沿有髓纖維束和在血管周圍間隙沿血管進(jìn)行遷移。因此,神經(jīng)膠質(zhì)瘤這種侵襲特性與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分密不可分。多種基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分已證實了在人膠質(zhì)瘤中過度表達(dá),如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白、玻連蛋白和腱糖蛋白,這些物質(zhì)都與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有著密切的聯(lián)系。 層粘連蛋白(laminin,LN)是一組細(xì)胞外基底膜異源三聚體的糖蛋白大家族,主要由α、β、γ這三種鏈不同的組合而構(gòu)成。層粘連蛋白在許多基本的生物過程中發(fā)揮著重要作用,包括細(xì)胞粘附和遷移、胚胎發(fā)育、腫瘤浸潤、血管生成、組織分化和傷口愈合等。層粘連蛋白不僅是血管基底膜的主要功能成分,也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要功能成分。而且,層粘連蛋白還是正常腦組織微血管BMs的主要組成成分。膠質(zhì)瘤細(xì)胞自身也能合成和分泌多種LN參與血管基底膜和血管基底膜構(gòu)成,也表達(dá)大量的整合素受體。有研究發(fā)現(xiàn)在低級別和高級別的膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)鄰近的正常腦組織中過度表達(dá)含α4鏈的LN。一種含α4鏈的LN亞型層粘連蛋白-8主要是在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和鄰近多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腦組織中的血管基底膜上表達(dá),而另一個含α4鏈的層粘連蛋白-9則主要在低級別膠質(zhì)瘤和正常組織血管基底膜表達(dá)。 LN-8是表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要亞型。LN-8已被證實與相應(yīng)的受體整合素結(jié)合,對于骨髓功能和血-腦屏障的維持起著十分重要的作用。LN-8還可以通過與整合素α3β1和α6β1的相互作用促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞黏附和遷移。過表達(dá)LN-8的GBM患者腫瘤復(fù)發(fā)時間和病人存活期與過表達(dá)LN-9的GBM患者相比較都有所縮短。而神經(jīng)膠質(zhì)瘤一個顯著特征在于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和顯著的腫瘤血管生成,后者是膠質(zhì)瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的一個重要的基礎(chǔ)條件。含α4鏈層粘連蛋白本身就能促進(jìn)腫瘤血管生成。以上所訴說明了LN-8在膠質(zhì)瘤的侵襲和腫瘤血管生成過程中發(fā)揮著重要作用,可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。隨著腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展,毛細(xì)管基底膜中含有α4鏈層粘連蛋白的表達(dá)會顯著上調(diào),并且含有β2鏈的LN-9(α4β2β1)會被含有β1鏈的LN-8(α4βγ1)所取代。LN-8和LN-9具有相似的結(jié)構(gòu),只是其中的β鏈不同。膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中含β2鏈LN-9轉(zhuǎn)變?yōu)楹?鏈(LAMB1) LN-8潛在的調(diào)節(jié)因素還尚為人所知。因此,對于LN-8的基因調(diào)控機(jī)制的研究就顯得非常有意義。 MicroRNAs新近發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于真核生物體中內(nèi)生的短鏈非編碼RNA,長約22nt(nt是核苷酸nucleotide的縮寫,lnt代表一個核苷酸單位)。MicroRNAs可以通過作用于相應(yīng)靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、侵襲和轉(zhuǎn)移,甚至還可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞活化及新生血管生成。MicroRNAs基因通常位于在癌基因組的染色體脆性位點,被認(rèn)為是一類新型的致癌基因和抑癌基因。在大多數(shù)實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)MicroRNAs表達(dá)水平的異常。這些異常表達(dá)的MicroRNAs還可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移性、下調(diào)多種靶基因的表達(dá)等等。腦部腫瘤MicroRNAs表達(dá)譜的一系列的研究也發(fā)現(xiàn)一些MicroRNAs的表達(dá)異常。這些表達(dá)異常的MicroRNAs基因位點通常位于典型的腦腫瘤的上游或下游信號通路,能調(diào)節(jié)腦腫瘤細(xì)胞的致癌表型。 MicroRNA-124在各種哺乳動物的胚胎和成年皮質(zhì)中大量表達(dá),是一類腦組織中表達(dá)最為豐富特有的microRNA,約占腦組織microRNAs總量的25%～48%。MicroRNA-124對于維持正常的神經(jīng)發(fā)育和功能有著重要的作用。對神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同的表達(dá)譜的研究卻發(fā)現(xiàn)miR-124在惡性程度較高的間變性星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級)中的表達(dá)量是顯著下調(diào)的,提示miR-124的下調(diào)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成和進(jìn)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-124在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的恢復(fù)抑制了各種靶基因的表達(dá),如lamininγ1和整合素β1,也抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲,從而延緩腫瘤的進(jìn)展。miR-124-3p(miR-124或者miR-124a)和miR-124-5p(miR-124*)都是miR-124的兩種成熟的形態(tài)(miR-124-5p在LAMB1的3'UTR一個公認(rèn)的結(jié)合位點是由鳥嘌呤取代胞嘧啶而發(fā)生突變[星號標(biāo)記])。miR-124-3p已證實在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)是下調(diào)的,而且與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)。但是miR-124-5p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)是否和niR-124-3p的結(jié)果一致還是未知數(shù)。因此,篩選出miR-124在膠質(zhì)瘤發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中確切的靶標(biāo)基因,對于膠質(zhì)瘤的診療非常有意義。 基于我們先前研究觀察到GBM細(xì)胞系和組織中l(wèi)amininβ1蛋白的高表達(dá)和miR-124-5p的低表達(dá)與膠質(zhì)瘤進(jìn)展關(guān)系,我們設(shè)想這兩者之間在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中是否存在相關(guān)關(guān)系。因此,本研究就針對miR-124-5p對lamininβ1的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行探討。我們首先通過Q-PCR和Western Blot方法檢測GBM細(xì)胞系(U87和U251)及不同級別臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-124-5p與LAMB1之間的表達(dá)水平,利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)驗證miR-124-5p對LAMB1(蛋白質(zhì))表達(dá)的調(diào)控作用。通過體內(nèi)、外研究對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和組織中miR-124-5p的高表達(dá)和LAMB1的敲減對于細(xì)胞增殖、克隆形成、腫瘤生長和血管生成所產(chǎn)生的影響進(jìn)行評估,驗證miR-124-5p對LAMB1潛在的調(diào)節(jié)作用。 第一部分各級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤層粘連蛋白-8和miR-124-5p的表達(dá)關(guān)系 目的：檢測層粘連蛋白-8LAMB1mRNA和蛋白,miR-124-5p在各級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平,并分析它們與神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展之間是否存在關(guān)聯(lián)。 方法：人U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。于珠江醫(yī)院神經(jīng)外科和病理科各級別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行采集及處理。采用Q-PCR和Western blots檢測非腫瘤性腦組織、Ⅰ/Ⅱ級膠質(zhì)瘤、間變性星形細(xì)胞瘤(AAs, WHO Ⅲ級),多形性膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤(GBMWHOⅣ級)和U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的LAMB1mRNA和蛋白、miR-124-5p的表達(dá)水平。 結(jié)果：LAMB1mRNA和蛋白在AAs和GBM組織中的表達(dá)水平相比較于正常腦組織和Ⅰ/Ⅱ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出顯著上調(diào),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的LAMB1表達(dá)量最高。MiR-124-5p在間變性星形細(xì)胞瘤(AAs, WHO Ⅲ級)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM WHO Ⅳ級)的表達(dá)量與正常腦組織和Ⅰ/Ⅱ級膠質(zhì)瘤相比顯著下調(diào)。對miR-124-5P表達(dá)水平與LAMB1mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行秩相關(guān)分析：miR-124-5p表達(dá)水平與LAMB1mRNA和蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：LAMB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別和嚴(yán)重程度的增加而提高,而miR-124-5p表達(dá)水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別和嚴(yán)重程度而下降,因此,miR-124-5p和LN-8可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物。下調(diào)的miR-124-5p和上調(diào)的LAMB1與膠質(zhì)瘤進(jìn)展相關(guān),兩者之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 第二部分Has-miR-124-5p調(diào)控LAMB1基因的表達(dá) 目的：驗證miR-124-5p是否對LAMB1轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控作用。 方法：采用MicroCosm Targets Version5microRNA靶基因預(yù)測軟件in silico分析miR-124-5p在LAMB13'UTR端結(jié)合位點。MiR-124-5p minic、NC (miRNA minic negative control)、miR-124-5p inhibitor和miRNA NC inhibitor脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分別利用Q-PCR和Western blots檢測U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LAMB1mRNA和蛋白水平。我們還利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)鑒定miR-124-5p對LAMB1(蛋白質(zhì))表達(dá)的調(diào)控作用。 結(jié)果：MicroRNA靶基因預(yù)測軟件in silico分析顯示miR-124-5p是LAMB13'UTR端結(jié)合位點。72小時后,轉(zhuǎn)染miR-124-5p minic過表達(dá)miR-124-5pU87和U251細(xì)胞的LAMB1蛋白水平相比于轉(zhuǎn)染NC的U87和U251細(xì)胞是下調(diào)的。轉(zhuǎn)染miR-124-5p inhibitor的U87和U251細(xì)胞的LAMB1蛋白水平相比于轉(zhuǎn)染NC inhibitor的U87和U251細(xì)胞是上調(diào)的。同時,LAMB1mRNA水平卻不受過表達(dá)或敲低miR-124-5p的影響。miR-124-5p對LAMB1基因的翻譯產(chǎn)生抑制作用。 結(jié)論：miR-124-5p對U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞LAMB1mRNA的表達(dá)無調(diào)節(jié)作用,對U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞LAMB1(蛋白)的轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)有直接的負(fù)調(diào)控作用。LAMB1是：miR-124-5p直接的靶基因。 第三部分MiR-124-5p表達(dá)恢復(fù)對異種移植膠質(zhì)瘤腫瘤生長和微血管密度的抑制作用 目的：評估m(xù)iR-124-5p表達(dá)的恢復(fù)對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和遷移以及腫瘤生長和血管生成產(chǎn)生的影響。 方法：1.體外實驗：miR-124-5p minic和miRNA minic negative control (NC)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞。利用MTT實驗和Transwell細(xì)胞遷移實驗對轉(zhuǎn)染miR-124-5p minic和NC (miRNA minic negative control)的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行分析。2.體內(nèi)實驗：建立免疫缺陷nu/nu裸鼠U87和U251皮下膠質(zhì)瘤動物模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150-200mm3,將小鼠隨機(jī)分配為2個處理組：miR-124-5p minic組和NC組(每組n=6),分別給予miR-124-5p minic和NC原位注射處理,監(jiān)測3個星期的腫瘤體積變化情況。利用Q-PCR, Western blots和免疫組化技術(shù)檢測各組腫瘤組織中LAMB1mRNA和蛋白水平變化；通過對腫瘤標(biāo)本的腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD31行免疫組化分析腫瘤微血管密度的變化。 結(jié)果：miR-124-5p對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲能力無調(diào)控作用。miR-124-5p minic組的腫瘤生長與NC組相比是受到抑制的。miR-124-5p minic組的LAMB1蛋白水平與NC組相比較是下調(diào)的,而niR-124-5p minic組的LAMB1mRNA水平與NC組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義。miR-124-5p minic組的腫瘤微血管密度與NC組相比較明顯下降。 結(jié)論：miR-124表達(dá)的恢復(fù)通過抑制LAMB1基因的蛋白表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤腫瘤血管生成和腫瘤生長受到抑制。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：1951666