本文選題：葫蘆素B + 神經(jīng)母細胞瘤�。� 參考：《華中科技大學》2014年博士論文

【摘要】：神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)是一種顱外惡性實體腫瘤,在兒童中最為常見,又成為“兒童癌癥之王”。它起源于外周交感神經(jīng)系統(tǒng),是由發(fā)育中的脊髓外層遷移過來的神經(jīng)母細胞或原始神經(jīng)嵴細胞衍化而來的,占兒童癌癥死亡總數(shù)的10%左右。在臨床表現(xiàn)上,由于患者年齡大小、腫瘤發(fā)生部位、所處范圍以及生物學特征的不同,NB的臨床表現(xiàn)也是多種多樣,因此對患者的預后也有很大差異。目前NB的治療方法主要包括單純觀察、手術(shù)治療、放射治療、化學治療以及生物治療等,根據(jù)患者所處的高、中、低風險分組的不同,治療強度也有所區(qū)別。盡管近年來隨著早期診斷技術(shù)的不斷的發(fā)展,NB患者的生存率也在顯著升高,但是高風險組患者的5年生存率依然很低。目前,化學治療在神經(jīng)母細胞瘤的治療中仍然扮演著重要角色,由于化療給病人帶來的痛苦和副作用比較嚴重等原因,因而使尋找新型的高效低毒藥物成了目前迫在眉睫的任務。 葫蘆素B是從葫蘆科植物中分離出來的一種四環(huán)三萜化合物,具有多種藥理學作用,如抗病毒、抗炎及抗癌等活性。由于其具有顯著的抗炎活性,因此在傳統(tǒng)的使用上主要用于慢性肝炎的治療。最受廣泛關(guān)注的是葫蘆素B的抗癌活性,它在多種腫瘤細胞中能通過不同的分子作用機制抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡,成為潛在的抗癌藥物。目前關(guān)于葫蘆素B對神經(jīng)母細胞瘤的作用還未知,更沒有其對該腫瘤細胞作用機理方面的研究。因此,本文以體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞為材料,首先對葫蘆素B對該細胞的抑制作用進行檢測,并在此基礎(chǔ)上對葫蘆素B抑制神經(jīng)母細胞瘤的分子作用機制進行系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下： 1)葫蘆素B能通過誘導細胞周期阻滯在G2/M期而抑制神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的增殖。采用MTT法檢測了葫蘆素B對SH-SY5Y細胞增殖的影響,結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度和時間依賴性的抑(?)SH-SY5Y細胞的增殖；PI單染后使用流式細胞儀檢測了葫蘆素B處理24h后細胞周期分布的變化,發(fā)現(xiàn)隨著藥物處理濃度的增加,處于G2/M期細胞數(shù)目積累,細胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯。 2)葫蘆素B能誘導SH-SY5Y細胞凋亡,促進細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、線粒體膜去極化和細胞內(nèi)Ca2+濃度上升。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測了葫蘆素B對SH-SY5Y細胞凋亡的影響,結(jié)果表明,葫蘆素B能夠濃度依賴性的誘導細胞早期凋亡；使用倒置光學顯微鏡和Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,經(jīng)過葫蘆素B處理前后細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學變化；DCFH-DA探針、JC-1熒光探針和Fluo-3AM熒光探針分別檢測了葫蘆素B處理前后細胞內(nèi)ROS、線粒體膜電位以及Ca2+等生理水平的變化,結(jié)果顯示,葫蘆素B處理后ROS出現(xiàn)積累,線粒體膜電位下降,胞漿內(nèi)鈣離子濃度上升,且均呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。 3)葫蘆素B通過調(diào)控與G2/M期運轉(zhuǎn)相關(guān)的蛋白及與凋亡相關(guān)的Bcl-2家族蛋白的表達水平來誘導SH-SY5Y細胞周期阻滯和凋亡,同時還能濃度依賴性的上調(diào)p53和p21的表達以及下調(diào)與腫瘤血管生成和細胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達。采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測了葫蘆素B處理24h后,與細胞G2/M期運轉(zhuǎn)和凋亡的相關(guān)基因及蛋白表達的變化,結(jié)果顯示,葫蘆素B能夠濃度依賴性的抑制Cyclin B1、CDK1和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平,而上調(diào)凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。此外,還檢測了葫蘆素B對caspase-3和9的活性以及p53和p21蛋白表達的影響,結(jié)果表明,葫蘆素B也能濃度依賴性的活化caspase-3和9,并促進p53和p21的表達。同時Western blot結(jié)果顯示,葫蘆素B還能抑制與血管生成相關(guān)的VEGF蛋白、與細胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的MMP-2, MMP-9和COX-2蛋白的表達。 4)葫蘆素B通過抑制JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達來抑制SH-SY5Y細胞增殖和誘導細胞凋亡。JAK2/STAT3信號通路在細胞增殖、分化、遷移和凋亡中起著重要作用。因此,我們首先通過Western blot法檢測了葫蘆素B處理24h后該信號通路相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度依賴性的抑制p-JAK2和p-STAT3的表達,而本底的JAK2和STAT3則沒有明顯的變化。使用該信號通路的抑制劑AG490和激活劑IL-6檢測了蛋白的變化,結(jié)果進一步證明了葫蘆素B能顯著抑制該信號通路的激活。為了檢測該信號通路與細胞增殖和凋亡的關(guān)系,采用了MTT和流式細胞儀檢測了葫蘆素B和抑制劑、激活劑處理后細胞增殖率和凋亡率的變化,結(jié)果進一步驗證了葫蘆素B能夠通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來抑制SH-SY5Y細胞增殖和凋亡。 5)MAPKs信號通路也參與調(diào)控葫蘆素B誘導的SH-SY5Y細胞增殖抑制和凋亡。MAPKs在細胞的生長增殖和分化與凋亡中也扮演重要角色。因此,通過Western blot法檢測葫蘆素B對該信號通路蛋白的影響,結(jié)果顯示,葫蘆素B能濃度依賴性的抑制ERK的激活,同時促進JNK和p38MAPK的激活。通過使用以上三種蛋白的抑制劑PD98059、SP600125和SB203580檢測蛋白表達變化,進一步證明葫蘆素B能誘導該信號通路的激活。MTT和流式細胞儀檢測了該信號通路與葫蘆素B誘導的SH-SY5Y細胞增殖抑制和凋亡的關(guān)系,結(jié)果表明MAPKs信號通路確實參與了葫蘆素B抑制SH-SY5Y細胞增殖和誘導凋亡的過程。 綜上所述,本文的研究結(jié)果表明,葫蘆素B能夠在體外抑制SH-SY5Y細胞增殖和誘導細胞凋亡
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 岑龍;吳江;;神經(jīng)母細胞瘤的診治新進展[J];廣東醫(yī)學;2013年02期

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本文編號：1934650