發(fā)布時間：2018-05-24 12:06

  本文選題：Stra13 + DEC1�。� 參考：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是影響運動功能障礙的一種神經退行性疾病。該病的主要病理特點為選擇性中腦黑質致密部(substanbtianigrapars compacta,SNpc)多巴胺能神經元的減少以及該區(qū)域內路易小體的堆積。PD的病因被認為是通過遺傳和微環(huán)境的相互聯(lián)合作用而導致多巴胺能神經元的死亡。其中,微環(huán)境因素包括氧化應激、內質網應激、神經炎癥,線粒體損傷、鈣離子平衡紊亂以及神經元細胞凋亡。近年來,有文獻報道多巴胺能神經元的死亡與調控中腦多巴胺能神經元再生相關的基因和信號通路網相關。已有研究顯示,PD與大量在中腦參與多巴胺能神經發(fā)生發(fā)展的轉錄因子相關。本課題通過在體和離體水平,應用分子生物學方法研究轉錄因子DEC1在MPTP/MPP+所誘導PD模型中多巴胺能神經元凋亡中的作用,為深入研究PD發(fā)病機制并為PD的靶向藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。人軟骨細胞差異表達蛋白(DEC1)是堿性螺旋環(huán)螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)超家族成員中的一員,該轉錄因子廣泛表達于正常組織,如軟骨、骨、腎、肺、心、肝、腦等。并且,DEC1可通過外界刺激(如缺氧、生長因子、激素、感染等)參與細胞凋亡、細胞分化、脂質代謝、晝夜節(jié)律、缺氧等反應。到目前為止,未有文獻報道DEC1與多巴胺能神經的發(fā)生或發(fā)展有關。但是,有文獻表明DEC1分布于中樞神經系統(tǒng)中的不同腦區(qū),該轉錄因子不僅與神經元細胞的可塑性有關,還與中樞神經系統(tǒng)的神經分化和神經成熟有關。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)DEC 1表達于中腦SNpc及腹側被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA),并且與酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)陽性細胞共表達。本研究根據(jù)之前的實驗基礎,發(fā)現(xiàn)在MPTP誘導PD模型小鼠中腦SNpc的DEC1表達較對照組小鼠明顯降低。在離體實驗中,MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡同時,DEC1表達也明顯下降,其結果與上述在體實驗結果相符合。為了進一步研究DEC1在MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡中的作用,我們通過DEC1高表達質粒和shDECl敲減質粒的轉染實驗發(fā)現(xiàn):過表達DEC1可部分取消由MPP+誘導的細胞凋亡,敲減DEC1可加重由MPP+誘導的細胞凋亡。同時,過度表達DEC1可取消由MPP+所致cleaved caspase 3/caspase 3增加而不能取消MPP+所致Bax/Bcl-2的增加。該結果提示DEC1減輕MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡主要通過降低caspase 3活性。應用LY294002或LiCl以抑制或激活PI3K/Akt通路,結果發(fā)現(xiàn)LY294002可加重而LiCl可取消由MPP+誘導的DEC1降低;過度表達DEC 1可明顯增加由MPP+所致的PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白表達降低,而不影響其他Akt下游靶基因,如p-Bad/Bad,p-FoxO1/FoxO1,該結果提示MPP+所致細胞凋亡是通過下調DEC1的表達并與降低PI3K/Akt通路相關蛋白相關。隨后,本研究應用不同年齡(四月齡和六月齡)兩種基因型(DEC1+/+、DEC1-/-)小鼠,研究DEC1基因敲除對中腦SNpc多巴胺神經元的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn),僅有年老(六月齡)小鼠DEC1基因缺失可引起其運動功能障礙,年輕和年老小鼠DEC1基因缺失均不能引起其學習和記憶功能障礙。在解剖學實驗中,我們發(fā)現(xiàn)僅有年老(六月齡)小鼠DEC1基因缺失可特異性地引起SNpcTH+細胞減少和該區(qū)域的細胞凋亡。同時,我們還發(fā)現(xiàn),年老(六月齡)DEC 1基因敲除小鼠中腦cleaved caspase 3/caspase 3及PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路相關蛋白表達較同年齡野生型小鼠表達降低。綜合以上實驗結果提示,成年DEC1基因缺失小鼠(6月齡),在行為學和解剖學上具有天然形成PD的傾向。這一結果從整體又應證了 DEC1在維持多巴胺神經元功能發(fā)揮了重要作用。本研究首次探討了轉錄因子DEC1在中腦SNpc多巴胺能神經元凋亡中的作用及機制,為PD發(fā)病機制、以DEC1為靶標的研究以及為PD基因基礎的新的動物模型的研究提供了新線索。文章主要分為兩部分進行研究闡述:第一部分:轉錄因子DEC1在MPTP/MPP+誘導多巴胺能神經凋亡中的作用及機制的研究第二部分:轉錄因子DEC1缺失對中腦黑質致密部多巴胺能神經元的的影響及其機制的研究第一部分:轉錄因子DEC1在MPTP/MPP+誘導的多巴胺能神經凋亡中的作用及機制的研究目的:研究轉錄因子DEC1在MPTP/MPP+誘導的細胞凋亡中的作用及機制。方法:本部分分為整體實驗和離體實驗1.整體實驗:給予C57BL/6小鼠連續(xù)皮下注射MPTP五天,制備PD亞急性模型。觀察對照組和造模組行為學改變,免疫熒光檢測小鼠中腦TH和DEC1蛋白表達。Western blot方法檢測MPTP造模后小鼠中腦TH、DEC1、DAT、凋亡相關蛋白(cleavedcaspase3,caspase3,Bax,Bcl-2)以及 PI3K/Akt 通路相關蛋白(PI3Kp11Oα、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)表達。2.離體實驗:以MPP+刺激SH-SY5Y細胞作為PD的細胞模型,研究DEC1在MPP+誘導神經毒性中的作用及機制。1)首先觀察DEC1在MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡過程中的變化。以及與多巴胺神經元的標志性蛋白(TH、DAT)、凋亡相關蛋白(cleaved caspase 3,caspase 3,Bax,Bcl-2)以及PI3K/Akt通路相關蛋白之間的關系。2)通過質粒轉染方法構建高表達和低表達DEC1的SHS-Y5Y細胞,用TUNEL染色檢測過表達和敲減DEC1在MPP+誘導細胞凋亡中的影響。3)通過過表達質粒檢測DEC1與TH、DAT以及凋亡相關蛋白的關系。4)應用藥物(LY294002或LiC1)抑制和激活PI3K/Akt通路,檢測DEC1在MPP+誘導凋亡中與該通路相關性。5)通過過表達DEC1檢測該轉錄因子在MPP+誘導SH-SY5Y細胞中對PI3K/Akt通路相關蛋白的影響,以探討其機制。結果:1.與對照組小鼠比較,MPTP造模小鼠(行為學證實)中腦SNpc和VTA TH和DAT表達降低,同時DEC1表達也明顯降低;2.MPTP 造模小鼠中腦凋亡相關蛋白(cleaved capase 3/caspase 3、Bax/1Bcl-2)較生理鹽水組小鼠比例顯著增高;PI3K/Akt通路相關蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β和 β-catenin)表達水平較生理鹽水組小鼠顯著降低;3.離體實驗中(SH-SY5Y細胞株),MPP+誘導細胞毒性并且抑制DEC1表達,引起凋亡相關蛋白cleaved capase 3/caspase 3及Bax/Bcl-2比值增高、TH和DAT表達降低,提示MPP+誘導的細胞凋亡可能與其降低DEC1有關;4.過表達DEC1可取消部分由MPP+誘導的細胞凋亡作用,敲減DEC1促進MPP+誘導的細胞凋亡作用;5.在SH-SY5Y細胞中過表達DEC1可取消一部分由MPP+誘導的cleaved capase 3/caspase 3的增高,但不影響由MPP+誘導的Bax/Bcl-2增高,同時,過表達DEC1部分取消MPP+引起的TH和DAT表達的降低;6.應用LY294002抑制PI3K/Akt通路,加重了 DEC1在MPP+誘導的細胞凋亡中的表達降低。應用LiCl激活PI3K/Akt通路,取消部分DEC1在MPP+誘導的細胞凋亡中的表達降低;7.在SH-SY5Y細胞中過表達DEC1,我們發(fā)現(xiàn)過表達DEC1選擇性地部分取消了由MPP+誘導的PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路蛋白的降低。該結果提示DEC1對多巴胺神經元的保護作用與PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路相關。結論:MPTP/MPP+下調DEC1在多巴胺能神經凋亡中與PI3K/Akt通路相關。第二部分:轉錄因子DEC1缺失對中腦黑質多巴胺能神經元的影響及其機制的研究目的:本文第一部工作結果發(fā)現(xiàn),MPTP/MPP+誘導的多巴胺神經元凋亡是通過下調DEC1表達介導的,提示DEC1與多巴胺神經凋亡相關。本部分研究主要利用兩種基因型(DEC1+/+、DEC1-/-)小鼠,研究并探討DEC1基因缺失對多巴胺能神經元的影響及機制。方法:1)利用不同年齡(四月齡和六月齡)的野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠進行行為學研究(開場實驗、爬桿實驗、轉棒實驗和Morris水迷宮實驗)。2)用免疫組化方法檢測四月齡和六月齡野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠中腦黑質區(qū)TH+細胞表達。Western blot方法檢測小鼠中腦TH和DAT蛋白表達。3)用尼氏染色方法檢測四月齡和六月齡野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠海馬和中腦神經元細胞變化。4)用TUNEL染色方法檢測四月齡和六月齡野生型(DEC1+/+)和基因敲除型(DEC1-/-)小鼠中腦凋亡細胞,用Western blot方法檢測小鼠中腦凋亡相關蛋白表達。5)應用Western blot方法檢測小鼠中腦PI3K/Akt通路相關蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)表達。結果:1.與同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠相比,六月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠在開場實驗、爬桿實驗和轉棒實驗中較同年齡的野生型(DEC1+/+)小鼠表現(xiàn)出自主運動能力和運動協(xié)調能力障礙;2.四月齡和六月齡同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠和基因敲除(DEC1-/-)小鼠在Morris水迷宮實驗中,學習及記憶能力均沒有明顯差異;3.六月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠SNpc TH+細胞明顯少于同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠。同時,轉錄因子DEC1缺失選擇性引起六月齡小鼠中腦SNpc神經元細胞缺失,而四月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠則無明顯變化;4.六月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠SNpc的細胞凋亡較同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠明顯增多。同時,六月齡基因敲除(DEC1-/)小鼠中腦凋亡相關蛋白caspase3和p53活性較同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠明顯增加,而四月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠則無明顯變化。5.與同齡同窩野生型(DEC1+/+)小鼠相比,六月齡DEC1基因缺失小鼠中腦PI3K/Akt 通路相關蛋白(PI3Kp110α、p-Akt(Ser473)/Akt、p-GSK-3β(Ser9)/GSK-3β、β-catenin)明顯降低,而四月齡基因敲除(DEC1-/-)小鼠則無明顯變化。結論:DEC1缺失通過PI3K/Akt通路影響caspase 3活性,促進小鼠中腦黑質致密部多巴胺能神經元細胞凋亡。
[Abstract]:Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease which affects motor dysfunction . The main pathological characteristics of PD are related to the reduction of dopaminergic neurons in the selective mesencephalon nigra pars compan ( SNpc ) and the accumulation of the neurons in the region . In order to further study the effect of DEC1 on the apoptosis induced by MPP + , it was found that the deletion of DEC1 gene induced by MPP + could decrease the expression of caspase 3 / caspase 3 induced by MPP + . The expression of TH , DEC1 , DAT , Bcl - 2 , caspase - 3 , caspase - 3 , caspase - 3 , Bax , Bcl - 2 , and apoptosis - related protein were detected by Western blot . The effect of DEC1 on dopaminergic neurons induced by MPP + was reduced by downregulating the expression of DEC1 . Conclusion : The effect of DEC1 on dopaminergic neurons induced by MPP + can be abolished by downregulating the expression of DEC1 . Compared with the wild type ( DEC1 - / - ) mice in the same age ( DEC1 - / - ) mice , there was no significant difference in learning and memory ability in mice with DEC1 - / - mice than that of the same age ( DEC1 - / - ) mice .
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳麗;何冬梅;井緒東;張洹;房寶英;;大鼠骨髓間充質干細胞向多巴胺能樣細胞的體外分化[J];基礎醫(yī)學與臨床;2008年04期

2 汪春運;;多巴胺能的中樞效應和藥物治療[J];四川精神衛(wèi)生;2012年02期

3 鄧學軍,孫圣剛,曹學兵,李紅戈;3-硝基丙酸預處理對多巴胺能神經元保護作用的研究[J];腦與神經疾病雜志;2004年03期

4 李銳;彭寧;杜芳;李旭平;樂衛(wèi)東;;表沒食子兒茶素沒食子酸酯的多巴胺能神經元保護作用(英文)[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年04期

5 劉世熠,張文遠,王澤盛,戴秀菊;膽堿能和多巴胺能化合物對豚鼠“踏步自動作用”的影響[J];生理學報;1981年02期

6 Kessler K A;劉正學;;抗精神藥物的臨床應用[J];國外醫(yī)學.精神病學分冊;1982年01期

7 馮建宇;內源性多巴胺能系統(tǒng)功能障礙所致的身材矮小及GH缺乏[J];國外醫(yī)學(兒科學分冊);1987年04期

8 杜鑫瑞;辛濤;滕良珠;邴國英;龐琦;;1-三氯甲基-l,2,3,4-四氫化-β-咔啉(TaClo)介導的體外培養(yǎng)多巴胺能神經元凋亡及其機制[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2011年08期

9 高方友;楊輝;張治元;;Nurr1基因與干細胞多巴胺能表型分化的研究進展[J];生理科學進展;2006年01期

10 栗超躍;惠國楨;暨荀鶴;史錫文;郭禮和;;多巴胺對多巴胺能神經母細胞SH-SY5Y的毒性作用[J];中華神經外科雜志;2007年11期

相關會議論文 前6條

1 程哲;鐘詠梅;;多巴胺轉運體在大鼠視網膜多巴胺能無長突細胞上的表達[A];中國神經科學學會第六屆學術會議暨學會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

2 朱文梅;D．I．Finkelstein;J．Drago;M．K．Horne;;L-DOPA對損傷后多巴胺能神經末梢再生修復的影響[A];第九次全國神經病學學術大會論文匯編[C];2006年

3 高方友;楊輝;張治元;;Nurr1基因與干細胞多巴胺能表型分化的研究進展[A];貴州省醫(yī)學會神經外科學分會第七屆學術交流會暨神經外科學新進展學習班論文集[C];2006年

4 吳云成;趙永波;劉文文;;短發(fā)夾RNA對多巴胺能細胞株外源綠色熒光蛋白基因表達的影響[A];2005年中國神經心理學學術會議論文集[C];2005年

5 呂立夏;徐磊;Neff F;Jurgen S;Oertel WH;Hirsch EC;Hartmann A;;多巴胺能(DA)神經元的差異表達譜及其潛在的蛋白-蛋白間相互作用[A];科技、工程與經濟社會協(xié)調發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學術年會論文集[C];2004年

6 陳晟;張曉潔;樂衛(wèi)東;;新型D2/D3受體激動劑Ropinirole對抗蛋白酶體抑制劑介導的多巴胺能神經元凋亡的機制研究[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經病學學術會議論文匯編[C];2010年

相關博士學位論文 前6條

1 朱朱;轉錄因子DEC1在多巴胺能神經元凋亡中的作用及其機制[D];南京醫(yī)科大學;2017年

2 高擎;血管緊張素Ⅱ對多巴胺能神經元凋亡的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2017年

3 白玫;慢性應激誘發(fā)抑郁的多巴胺能神經通路異常機制[D];中南大學;2013年

4 王黎;多巴胺能神經元胞體和突觸分泌的機制[D];北京大學;2013年

5 王愛萍;可持續(xù)多巴胺能刺激治療帕金森病的羅替戈汀微球的研究[D];吉林大學;2012年

6 李愛群;阿樸嗎啡促進多巴胺能神經元存活的機理研究[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2006年

相關碩士學位論文 前6條

1 汪婷美;嘌呤生物堿Theacrine通過Sirt3調控線粒體蛋白去乙酰化發(fā)揮多巴胺能神經元保護作用和機制研究[D];暨南大學;2016年

2 張思源;GDNF對6-OHDA所致PD模型大鼠多巴胺能神經元保護作用的研究[D];四川大學;2004年

3 胡燕;Genistein對多巴胺能神經元保護作用的體外實驗研究[D];南通大學;2006年

4 陳潔;LRRK2突變體誘導人多巴胺能神經元凋亡的蛋白組學的初步研究[D];復旦大學;2009年

5 張俊;應用Bac-to-Bac桿狀病毒表達體系在sf9細胞中重組表達保守性多巴胺能神經營養(yǎng)因子[D];安徽醫(yī)科大學;2011年

6 鄭剛;MPP～+對PC12細胞體外增殖的抑制作用及其機制探討[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

，

本文編號：1928985