本文選題：RGMa + 顳葉癲癇　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一部分RGMa在難治性TLE患者及動物模型腦組織中的表達(dá) 目的：苔蘚纖維出芽是顳葉癲癇的一個常見組織病理學(xué)特征，可導(dǎo)致海馬突觸重組，在癲癇的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。RGMa（Repulsive Guidance Molecule a）是一種排斥性軸突導(dǎo)向因子，主要起抑制軸突生長的作用。本研究首先檢測了RGMa在藥物難治性顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）患者腦組織及氯化鋰-匹羅卡品（LiCl-PILO）癲癇大鼠模型中的表達(dá)，以初步探討RGMa在TLE發(fā)生發(fā)展中的可能作用。 方法： 1.23例難治性TLE患者顳葉皮質(zhì)和10例非癲癇對照組顳葉皮質(zhì)隨機(jī)取自課題組所建立的耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織標(biāo)本庫。 2.63只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為癲癇組（n=54）和對照組（n=9），癲癇組又分為6個亞組，即6h組，72h組，7d組，14d組，30d組，60d組（每組n=9），癲癇組大鼠給LiCl-PILO造模。 3.用免疫熒光雙標(biāo)、免疫組化和免疫印跡方法檢測RGMa在顳葉癲癇患者及癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.免疫組化提示，RGMa蛋白主要在顳葉癲癇患者及對照患者顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)。RGMa在TLE患者腦組織中的免疫組化平均光密度值（OD）顯著低于對照組（p0.05）。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果提示RGMa主要在神經(jīng)元中表達(dá)，而不在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示RGMa在對照組表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而在TLE組中則為弱陽性， TLE患者顳葉皮質(zhì)RGMa表達(dá)顯著低于對照組（p0.05）。 2.在氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠及對照組海馬各區(qū)及海馬周圍皮質(zhì)中均可見RGMa免疫組化陽性染色，海馬齒狀回區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)陽性最明顯。海馬組織的RGMa免疫組化平均OD值在大鼠造模后各時間點呈逐漸降低的趨勢。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果提示RGMa在大鼠海馬及周圍皮質(zhì)神經(jīng)元中表達(dá)，而不在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，RGMa在潛伏期及慢性期表達(dá)均降低。與對照組相比，RGMa在癲癇各時間點組大鼠海馬的表達(dá)均有差異（p0.05）。 結(jié)論：RGMa在難治性顳葉癲癇患者及氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型腦組織中表達(dá)均下調(diào)，提示RGMa可能參與了顳葉癲癇的發(fā)生發(fā)展。 第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染海馬過表達(dá)RGMa對癲癇大鼠行為學(xué)的影響 目的：為進(jìn)一步探討RGMa在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建了過表達(dá)RGMa基因的慢病毒載體，通過海馬立體定位注射以增加大鼠海馬RGMa表達(dá)，觀察了過表達(dá)RGMa對LiCl-PILO癲癇急性模型、慢性模型以及戊四氮化學(xué)點燃模型大鼠行為學(xué)的影響。 方法： 1.成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組：海馬立體定位注射慢病毒空載體組（LV-empty）,海馬立體定位注射慢病毒RGMa組（LV-RGMa），未注射組（control）。分別用免疫熒光、免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)染效率。 2.急性癲癇動物模型行為學(xué)觀察：造模前成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為Control組、LV-empty組及LV-RGMa組。大鼠雙側(cè)海馬注射慢病毒一周后造模，LiCl-PILO造模之后2h內(nèi)分別記錄每30分鐘間隔的Racine評分以及大鼠從注射PILO到首次出現(xiàn)IV級及以上行為的發(fā)作時間（癲癇發(fā)作的潛伏期）。 3.點燃動物慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作行為學(xué)觀察：大鼠在LiCl-PILO造模達(dá)到SE標(biāo)準(zhǔn)后隨機(jī)分為三組：慢病毒空載體海馬立體定位注射組（EP+LV-empty）、慢病毒RGMa海馬立體定位注射組（EP+LV-RGMa）、未注射組（EP），持續(xù)視頻監(jiān)測記錄大鼠癲癇自發(fā)性發(fā)作（SRS）的頻率及Racine評分。 4.戊四氮（PTZ）化學(xué)點燃模型行為學(xué)觀察：成年SD大鼠隨機(jī)分為LV-empty組和LV-RGMa組，慢病毒注射后3天，每天給予閾下劑量的PTZ注射后，觀察并記錄癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度評分及從注射PTZ第一天至癲癇成功點燃的時間（潛伏期）。 結(jié)果： 1.慢病毒RGMa雙側(cè)海馬立體定位注射后，海馬RGMa表達(dá)升高。與相應(yīng)時間點對照組相比，RGMa的OD比值在慢病毒注射后3d組,7d組,35d組顯著升高（p0.05），7d組升高最明顯。免疫熒光結(jié)果顯示EGFP陽性表達(dá)位于海馬，尤其是齒狀回區(qū)。 2.匹羅卡品注射后，大鼠癲癇發(fā)作的平均Racine評分逐漸升高。在每30min時間間隔內(nèi)，LV-RGMa組的平均癲癇發(fā)作評分比LV-empty組低（p0.05）。與LV-empty組相比，LV-RGMa組癲癇發(fā)作的潛伏期顯著延長（p0.05）。 3. LiCl-PILO誘導(dǎo)SE后慢性期內(nèi)（21-35d），與LV-empty相比，LV-RGMa組平均SRS頻率減少（p0.05），平均Racine評分降低（p0.05）。 4.在戊四氮點燃過程中，與LV-empty組比，LV-RGMa組平均點燃潛伏期延長（p0.05），平均癲癇發(fā)作評分降低（p0.05）。 結(jié)論： 1.慢病毒RGMa海馬立體定位注射后可增加海馬RGMa的表達(dá)，轉(zhuǎn)染在注射后3d有效，持續(xù)至35d。 2.慢病毒介導(dǎo)的海馬RGMa過表達(dá)能減輕LiCl-PILO誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度并降低癲癇發(fā)作的易感性。 3.海馬RGMa過表達(dá)能減少LiCl-PILO癲癇模型慢性期自發(fā)性癲癇發(fā)作的頻率并減輕發(fā)作嚴(yán)重程度。 4.海馬RGMa過表達(dá)延長PTZ點燃癲癇的潛伏期并減輕發(fā)作嚴(yán)重程度。 第三部分RGMa對癲癇大鼠苔蘚纖維芽生的影響及可能機(jī)制 目的：為了解RGMa對癲癇動物海馬苔蘚纖維芽生的影響，我們在LiCl-PILO大鼠造模后35天進(jìn)行了硝酸銀染色以觀察RGMa過表達(dá)對苔蘚纖維出芽（MSF）的影響，并同時檢測了與軸突生長密切相關(guān)的RhoA、Cdc42及Rac1的表達(dá)，以探討RGMa影響MSF的可能機(jī)制。 方法： 1.成年雄性SD大鼠造模前隨機(jī)分為正常對照組（control）和癲癇組，癲癇組又根據(jù)造模后海馬立體定位注射試劑的不同分為：未注射組（EP）、慢病毒空載體組（EP+LV-empty）及慢病毒RGMa組(EP+LV-RGMa)。 2.用Timm組織化學(xué)染色方法觀察各組MSF并對MSF的嚴(yán)重性進(jìn)行Timm評分。 3.用蛋白免疫印跡方法檢測造模后35d大鼠海馬RhoA、Cdc42及Rac1的表達(dá)。 結(jié)果： 1.EP+LV-empty組海馬齒狀回顆粒細(xì)胞上層見明顯的Timm顆粒，，與control組比較，EP+LV-empty組平均Timm評分顯著升高（p0.05），但EP+LV-RGMa組平均Timm評分較EP+LV-empty組顯著降低（p0.05）。 2.蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，與control組相比，EP組、EP+LV-empty組及EP+LV-RGMa組RhoA的平均OD比值明顯升高，與EP+LV-empty組比較，EP+LV-RGMa組OD值顯著升高（p0.05），而EP組和EP+LV-empty組之間沒有差異(p0.05)。 3.同時，我們還發(fā)現(xiàn)，與control組比較，EP組和EP+LV-empty組Cdc42及Rac1表達(dá)顯著升高（p0.05），EP+LV-RGMa組Cdc42及Rac1的表達(dá)較EP+LV-empty組降低（p0.05），而EP組和EP+LV-empty組之間沒有差異(p0.05)。 結(jié)論： 1.慢病毒介導(dǎo)海馬RGMa過表達(dá)能減輕癲癇大鼠海馬的苔蘚纖維出芽。 2.慢病毒介導(dǎo)海馬RGMa過表達(dá)調(diào)節(jié)了海馬RhoA，Cdc42及Rac1的表達(dá)，可能與RGMa影響苔蘚纖維出芽有關(guān)。 第四部分海馬RGMa過表達(dá)對大鼠神經(jīng)元興奮性的影響 目的：為了研究RGMa在癲癇發(fā)作中的可能機(jī)制，我們采用無Mg2+人工腦脊液誘導(dǎo)腦片放電模型研究了過表達(dá)RGMa對海馬神經(jīng)元興奮性的影響。 方法： 1.SD大鼠隨機(jī)分為三組：海馬注射慢病毒空載體組（LV-empty）,海馬注射慢病毒RGMa組（LV-RGMa），未注射對照組（Control）。病毒注射后1周處死動物用于制備腦片。 2.用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄0Mg2+人工腦脊液（ACSF）誘導(dǎo)各組腦片海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞動作電位（AP）、微小興奮性突觸后電流（mEPSC）及誘發(fā)興奮性突觸后電流（evoked EPSC）。 結(jié)果： 1.0Mg2+ACSF誘發(fā)的AP頻率在LV-RGMa組顯著低于LV-empty組或control組（p0.05）；mEPSC的頻率和幅值在LV-RGMa組顯著低于control組或LV-empty組（p0.05）。 2.與control組和LV-empty組相比，LV-RGMa組的NMDA/AMPA電流比值顯著降低（p0.05），且LV-RGMa組的NMDA介導(dǎo)EPSCs幅值顯著降低（p0.05）而AMPA介導(dǎo)EPSCs幅值沒有顯著差異（p0.05）。 結(jié)論： 1. RGMa過表達(dá)能抑制0Mg2+ACSF誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的過度興奮。 2. RGMa過表達(dá)能選擇性抑制海馬腦片NMDAR介導(dǎo)的突觸電流。
[Abstract]:The first part is the expression of RGMa in intractable TLE patients and animal models.
Objective: moss fiber buds, a common histopathological feature of temporal lobe epilepsy, can cause synapse recombination in the hippocampus, and play an important role in the pathogenesis of epilepsy,.RGMa (Repulsive Guidance Molecule a) is a repellent axon guiding factor, which mainly inhibits the role of axon growth. This study first detected RGMa in the drug. The expression of brain tissue and lithium pilocarpine (LiCl-PILO) epileptic rat model of temporal lobe epilepsy (TLE) is a preliminary study of the possible role of RGMa in the development of TLE.
Method錛

本文編號：1912960