本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化 + 轉(zhuǎn)基因小鼠　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種慢性、進行性、致死性神經(jīng)變性疾病,發(fā)病率約為5/10萬至7/10萬,臨床患者約90%為散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(SALS),余為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(FALS),二者的臨床表現(xiàn)及病理特點相似,患者一般在出現(xiàn)癥狀后的3~5年內(nèi)病情進行性加重,最終因肌肉萎縮無力、呼吸衰竭而死亡。目前尚無有效的治療方法。SALS的病因還不明確。經(jīng)大量的FALS患者研究證實,20%的病例由銅/鋅超氧化物歧化酶1基因(SOD1)突變引起。G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠(ALS小鼠)模擬人類ALS疾病的臨床特點,被用作研究ALS病理機制的工具鼠。高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠約在12周齡時后肢開始出現(xiàn)運動功能障礙癥狀,并逐漸進展,約17-20周齡發(fā)展到終末,病理表現(xiàn)與人ALS相似的致命的運動神經(jīng)元的變性。研究認(rèn)為突變的SOD1蛋白錯誤折疊,易形成聚集體,對降解短壽命蛋白質(zhì)的泛素蛋白酶體系統(tǒng)抵抗,具有細(xì)胞毒性,是導(dǎo)致家族性ALS疾病的機制之一。自噬(autophagy)可以清除長壽命蛋白質(zhì)、錯誤折疊蛋白質(zhì)及衰老損傷細(xì)胞器,是高度保守的細(xì)胞生物學(xué)行為。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),自噬是清除錯誤折疊蛋白的重要途徑,以維持神經(jīng)元的正常生理功能。因此研究有效降解突變SOD1蛋白對ALS疾病治療具有重要意義。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)含有70個氨基酸,是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似,相對分子質(zhì)量為7 649,通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌的三種途徑產(chǎn)生的低分子多肽。IGF-1參與生物體內(nèi)多種重要生理功能,其重要作用之一是有助于修復(fù)神經(jīng)的損害。應(yīng)用腺相關(guān)病毒血清2型(adeno-associated virus 2,AAV2)攜帶人單鏈IGF1基因(AAV2-hIGF1)肌肉注射經(jīng)神經(jīng)逆軸漿運輸干預(yù)G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠,其發(fā)病明顯推遲、生存期延長,研究發(fā)現(xiàn)IGF1激活A(yù)LS小鼠的脊髓運動神經(jīng)元自噬通路,抑制運動神經(jīng)元凋亡,從而保護了運動神經(jīng)元,該實驗沒有報道突變的sod1蛋白水平變化,我們推測可能是在自噬激活參與下使致病的sod1蛋白水平下調(diào)減輕了對運動神經(jīng)元的毒性。本研究我們應(yīng)用親神經(jīng)的腺相關(guān)病毒血清9型(aav9)攜帶編碼雙鏈的higf1基因(scaav9-higf1)經(jīng)鞘內(nèi)注射的途徑干預(yù)g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察其行為學(xué)變化,探索表達higf1對als小鼠突變sod1蛋白表達及病理的影響,并進一步采用crispr-cas9系統(tǒng),通過給g93a-sod1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scaav9-sgrna-igf1-cas9以敲降小鼠自身igf1,探索對als小鼠突變sod1蛋白表達及病理是否呈反方向影響。我們查閱國內(nèi)外文獻類似報道極少。第一部分鞘內(nèi)注射scaav9-higf1對als小鼠模型行為學(xué)及突變sod1蛋白的影響目的:我們應(yīng)用親神經(jīng)性的腺相關(guān)病毒血清型9(aav9)攜帶編碼雙鏈的人igf1基因(scaav9-higf1)經(jīng)鞘內(nèi)注射途徑干預(yù)60天齡、90天齡g93a-sod1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠,觀察干預(yù)后其行為學(xué)變化,研究表達higf1對als小鼠突變sod1蛋白表達及病理的影響。方法:我們選取美國jackson實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因g93a-sod1小鼠為動物模型,應(yīng)用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因g93a-sod1仔鼠進行dna鑒定,陽性的g93a-sodl轉(zhuǎn)基因雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試對象。60天齡時、90天齡時的g93a-sod1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scaav9-higf1,對照組鞘內(nèi)注射aav9-gfp,各15對。另外選取60天齡時g93a-sod1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠10對,隨機分別給予鞘內(nèi)注射scaav9-higf1/aav9-gfp,其中3對鞘內(nèi)注射3周時新鮮取材提取蛋白,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗觀測轉(zhuǎn)染后higf1表達、分布特點,1對用4%的多聚甲醛液灌注固定,通過免疫熒光雙染觀測腰髓組織振蕩切片higf1表達特點;其中3對110天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定,通過免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法觀測腰髓組織振蕩切片病理變化特征;余3對110天齡時新鮮取材,通過蛋白印跡分析研究gfap、cd11b、sod1、lc3、p62表達特點,通過rt-pcr研究sod1的mrna轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:1所有納入實驗的小鼠經(jīng)dna鑒定,核實為g93a-sod1轉(zhuǎn)基因陽性的雌鼠。2給予g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠鞘內(nèi)注射scaav9-higf1/aav9-gfp,3周時新鮮取材提取蛋白,酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示higf1在神經(jīng)組織中都有表達,腰段脊髓、胸段脊髓、頸段脊髓、腦干組織中higf1濃度呈遞減趨勢,腰段脊髓higf1濃度最高,腦干組織中higf1最低;經(jīng)4%的多聚甲醛液灌注固定的腰髓組織振蕩切片免疫熒光雙染小顯示higf1主要表達在運動神經(jīng)元。3給予g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠鞘內(nèi)注射scaav9-higf1,改善了小鼠的運動功能,60天齡治療與對照組中位數(shù)相比延遲發(fā)病20天、延長生存期44天,90天齡治療延長生存期38天(p㩳0.01),認(rèn)為治療組與對照組相比發(fā)病顯著推遲、生存期顯著延長。4g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠表達higf1,110天齡時灌注取材腰髓切片經(jīng)免疫熒光雙染色顯示結(jié)果顯示治療組的運動神經(jīng)元丟失較對照組明顯少;治療組星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞增生較對照組明顯少。同期取材的蛋白印跡結(jié)果顯示治療組gfap、cd11b蛋白表達水平低于對照組(p㩳0.05)。5g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠表達higf1,110天齡時新鮮腰髓取材的蛋白印跡顯示治療組的突變sod1蛋白表達水平低于對照組,治療組的lc3蛋白表達水平高于對照組,治療組的p62蛋白表達水平低于對照組,(p值均小于0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;其脊髓腰彭大部分經(jīng)超聲勻漿用rna試劑盒提取總rna,經(jīng)rt-pcr反轉(zhuǎn)錄,治療組與對照組的Δct值經(jīng)統(tǒng)計分析,p㧐0.05,認(rèn)為組間的sod1的mrna轉(zhuǎn)錄水平無差異。第二部分表達higf1對als小鼠模型運動神經(jīng)元保護作用研究目的:我們給60天齡轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scaav9-higf1,研究表達hihg1如何抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增生發(fā)揮對運動神經(jīng)元的保護。方法:我們選取美國jackson實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因g93a-sod1小鼠為動物模型,應(yīng)用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因g93a-sod1小鼠進行pcr鑒定,dna鑒定為sod1陽性的轉(zhuǎn)基因g93a-sodl雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試對象。60天齡時的g93a-sod1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠6對隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scaav9-higf1,對照組鞘內(nèi)注射aav9-gfp,其中3對110天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定,通過免疫熒光法染色觀測tgf-β、arginase、ikbα、ikkγ在腰髓神經(jīng)組織切片表達分布變化特征;余3對110天齡時新鮮取材,通過蛋白印跡分析研究inos、tnf-α、arginase、tgf-β、cyld、ikbα、ikkβ、ikkγ、pp65表達特點。結(jié)果:1g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠表達higf1,110天齡時組間的腰髓切片免疫熒光雙染色顯示治療組的arginase、tgf-β主要表達在神經(jīng)元,其熒光強度水平高于對照組,arginase、tgf-β的蛋白印跡灰度比對值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,認(rèn)為治療組arginase、tgf-β表達水平明顯高于對照組(p㩳0.05)。2g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠表達higf1,inos、tnf-α的蛋白印達水平明顯低于對照組。3g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠表達higf1,110天齡時組間的腰髓切片免疫熒光雙染色顯示ikbα在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達,治療組的熒光強度高于對照組;免疫熒光雙染色顯示ikbγ主要表達在小膠質(zhì)細(xì)胞,治療組的熒光強度低于對照組。蛋白印跡灰度比對結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示:治療組的ikkβ、ikkγ、pp65表達水平明顯低于對照組(p㩳0.05);治療組的cyld、ikbα表達水平明顯高于對照組(p㩳0.05)。第三部分鞘內(nèi)注射scaav9-sgrna-igf1-cas9對als小鼠模型行為學(xué)影響及機制研究目的:我們采用crispr-cas9系統(tǒng),通過給g93a-sod1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scaav9-sgrna-igf1-cas9,觀測敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠igf1的mrna對其行為學(xué)的影響,進一步研究敲降igf1對突變sod1蛋白表達及nf-κb通路上信號分子的影響。方法:我們選取美國jackson實驗室提供的肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因g93a-sod1小鼠為動物模型,應(yīng)用其提供的引物序列和鑒定方法對轉(zhuǎn)基因g93a-sod1小鼠進行pcr鑒定,dna鑒定為sod1陽性的轉(zhuǎn)基因g93a-sodl雌性小鼠經(jīng)同窩配對作為受試對象。30天齡時的g93a-sod1轉(zhuǎn)基因陽性同窩雌性小鼠7對隨機分配到藥物治療組鞘內(nèi)注射scaav9-sgrna-igf1-cas9,對照組鞘內(nèi)注射scaav9-sgrna-lacz-cas9,觀察行為學(xué)變化、發(fā)病及生存期。另外選取6對以同樣的干預(yù)方法進行機制研究,其中3對90天齡時用4%的多聚甲醛液灌注固定,通過免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法觀測ikkβ、pp65在腰髓神經(jīng)組織切片表達分布變化特征;余3對90天齡時新鮮取材,通過蛋白印跡分析研究sod1、lc3、p62、inos、tnf-α、arginase、migf1、tgf-β、cyld、ikbα、ikkβ、ikkγ、pp65表達特點。結(jié)果:1敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,小鼠的體重、評分從70天齡時治療組較對照組低,同時轉(zhuǎn)輪在80天齡時治療組較對照組低,顯示運動功能損害治療組發(fā)生更早;發(fā)病、生存期中位數(shù)治療組與對照組相比:治療組提前10天發(fā)病,提前16天終末,數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析p㩳0.01,具有極顯著差異。2降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,90天齡小鼠腰髓組織切片免疫組織化學(xué)方法染色smi32、gfap、iba-1,結(jié)果顯示治療組的運動神經(jīng)元丟失較對照組明顯多,治療組星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞增生較對照組明顯多。3敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,蛋白印跡結(jié)果顯示:90天齡治療組突變sod1蛋白表達水平明顯高于對照組(p㩳0.05)。治療組的lc3-bⅡ蛋白表達水平明顯低于對照組(p㩳0.05)。4敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,90天齡時取其新鮮腰髓進行的蛋白印跡實驗結(jié)果顯示:治療組arginase、tgf-β、migf1的表達水平明顯低于對照組(p㩳0.05)。5敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,90天齡時取其新鮮腰髓進行蛋白印跡實驗,結(jié)果顯示治療組的inos、tnf-α蛋白表達水平明顯高于對照組(p㩳0.05)。6敲降g93a-sod1轉(zhuǎn)基因小鼠igf1,90天齡時灌注取材,腰髓膨大部分切片進行ikkβ、pp665免疫熒光雙染色,結(jié)果顯示pp65主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞,治療組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較對照組多,治療組的熒光強度強于對照組。ikkβ在小膠質(zhì)細(xì)胞和非小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達;90天齡時取其新鮮腰髓進行蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,治療組的nf-κb信號通路正向調(diào)節(jié)因子ikkβ、ikkγ、pp65水平明顯高于對照組(p㩳0.05),治療組的nf-κb信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子cyld、ikbα明顯低于對照組(p㩳0.05)。結(jié)論:1通過查閱文獻資料,綜合分析所取得的實驗結(jié)果,認(rèn)為突變sod1蛋白、炎性因子inos、tnf-α、nf-κb通路、igf1之間存在這樣的關(guān)聯(lián),即在als小鼠表達higf1促進突變sod1降解,減輕了運動神經(jīng)元的毒害作用,inos、tnf-α呈現(xiàn)低表達,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增生,下調(diào)nf-κb通路信號因子表達,進一步減輕了對運動神經(jīng)元損傷性作用,臨床表現(xiàn)為als小鼠發(fā)病延遲、生存期延長。2相反,在als小鼠脊髓敲降igf1使突變sod1降解受阻,其表達累積增加、毒性加劇,加重了對運動神經(jīng)元的毒害作用,inos、tnf-α呈現(xiàn)高表達,小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,進而上調(diào)NF-κB通路信號因子表達,加重對運動神經(jīng)元產(chǎn)生了損害作用,因而臨床表現(xiàn)為提前發(fā)病、生存期縮短。3基于以上研究結(jié)果我們認(rèn)為突變SOD1蛋白毒性致使運動神經(jīng)元發(fā)生炎性反應(yīng),炎性因子表達上調(diào),刺激小膠質(zhì)細(xì)胞增生活化,炎性級聯(lián)發(fā)生,共同參與了ALS疾病的發(fā)生,但其信號介導(dǎo)通路仍有待進一步研究。4通過對ALS小鼠基因治療表達hIGF1促進了突變SOD1蛋白降解,抑制了以上病理進展從而發(fā)揮了治療效應(yīng),屬于對因治療,為臨床ALS疾病的治療提供了實驗依據(jù),本實驗同時提示抑制炎性反應(yīng)過程的各個環(huán)節(jié)都是治療ALS疾病的靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R744.8

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本文編號：1901430