本文選題：介孔二氧化硅 + 聚多巴胺　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分NGR修飾載DOX的二氧化硅納米粒制備及檢測目的選用阿霉素(DOX)為目標(biāo)藥物,介孔二氧化硅(MSN)作為藥物載體,經(jīng)聚多巴胺(PDA)涂層包裹,Asn-Gly-Arg(NGR)肽作為靶向配體并與PDA共價(jià)結(jié)合,制備一種新型的針對膠質(zhì)瘤及腫瘤血管內(nèi)皮雙靶向性納米粒(MSN-DOX-PDA-NGR),并對其表征和特性進(jìn)行鑒定和檢測。方法將MSN與DOX溶液室溫下混合攪拌,使DOX進(jìn)入MSN的介孔中,分離純化并真空干燥后與鹽酸多巴胺反應(yīng),使MSN-DOX表面包被一層聚多巴胺外殼,得到MSN-DOX-PDA,洗滌后將MSN-DOX-PDA加入到NGR水溶液中,使NGR與聚多巴胺外殼共價(jià)結(jié)合,得到MSN-DOX-PDA-NGR。分別檢測微粒的粒徑、Z電勢,計(jì)算載藥量,并測定不同p H值下藥物的釋放速度。結(jié)果電子顯微鏡檢測出微粒的直徑為160.1±1.49nm,表面電位為-22±0.97m V。通過分光光度法檢測微粒制備過程中未包被的DOX量計(jì)算出DOX載藥率和包封率分別為19.02%和40.84%。體外釋藥實(shí)驗(yàn)顯示DOX在中性環(huán)境下釋放率極低,在酸性環(huán)境下釋放速度快,24小時(shí)累計(jì)釋放率可達(dá)到近50%。結(jié)論本研究成功制備出一種平均粒徑約160nm的載DOX納米粒,有較高的載藥率和包封率,能在中性環(huán)境下穩(wěn)定存在,酸性環(huán)境下穩(wěn)定釋放,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第二部分MSN-DOX-PDA-NGR雙靶向性的體外研究目的對成功構(gòu)建的MSN-DOX-PDA-NGR雙靶向納米粒進(jìn)行一系列的體外評價(jià):細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、競爭抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞攝取機(jī)制實(shí)驗(yàn)、亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn),體外血腦屏障(BBB)模型實(shí)驗(yàn),以此評估納米粒對膠質(zhì)瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性及雙靶向性。方法培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(C6),原代分離培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(AC)、大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC),用transwell建立BCEC-C6及BCEC-AC共培養(yǎng)體系,用流式細(xì)胞技術(shù)及western blotting法檢測C6、AC、BCEC、BCEC-C6、BCEC-AC這五種細(xì)胞中CD13的表達(dá)量。用流式細(xì)胞技術(shù)及激光共聚焦分別定量定性檢測C6及BCEC-C6對MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR的攝取作用,以評估納米粒的細(xì)胞雙靶向性及競爭抑制作用。用CCK-8法檢測free DOX、MSN-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR的細(xì)胞毒性作用,計(jì)算出IC50值來評估載藥納米粒的細(xì)胞毒性及空載體的生物安全性。同時(shí),選取人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251)、小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(GL261)進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),用以評估納米粒在不同種屬間的細(xì)胞靶向性和細(xì)胞毒性。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測預(yù)孵了各種抑制劑的C6及BCEC-C6細(xì)胞攝取MSN-DOX-PDA-NGR后的熒光強(qiáng)度,以探索細(xì)胞的攝取機(jī)制。用激光共定位技術(shù)觀察納米粒和溶酶體在細(xì)胞內(nèi)的相對位置,探索納米粒的亞細(xì)胞定位。用高效液相色譜法檢測體外血腦屏障模型中各種DOX制劑的跨BBB比率,以評估納米粒對BBB的穿透能力。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測共培養(yǎng)模型中C6細(xì)胞對納米粒的攝取,用CCK-8法檢測納米粒對C6細(xì)胞的毒性作用,以評估納米�？缒ず蟮陌邢蚰芰图�(xì)胞毒性作用。結(jié)果C6、BCEC-C6細(xì)胞中的CD13表達(dá)量明顯高于AC、BCEC、BCEC-AC。定性定量結(jié)果均顯示MSN-DOX-PDA-NGR對C6、BCEC-C6、U251細(xì)胞的特異識(shí)別能力顯著高于MSN-DOX-PDA;加入free NGR預(yù)孵后,MSN-DOX-PDA-NGR對靶細(xì)胞的特異識(shí)別和攝取能力被競爭性抑制,但在GL261細(xì)胞中沒有得到類似的結(jié)果。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,DOX制劑的細(xì)胞毒性作用呈濃度及時(shí)間依賴性。空載體MSN-PDA-NGR的濃度在達(dá)到1000μg/ml,孵育時(shí)間達(dá)到96小時(shí)的情況下,細(xì)胞活力仍高于80%。對C6細(xì)胞而言,DOX、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR 24小時(shí)的IC50值分別是16.90、138.1、5.09、59.71μg/m L,48小時(shí)的IC50值分別是7.608、9.85、1.74、10.61μg/m L。與無NGR修飾的MSN-DOX-PDA比較,NGR的修飾能顯著降低MSN-DOX-PDA-NGR的IC50值,孵育24小時(shí)降低27.13倍,孵育48小時(shí)降低5.66倍;游離NGR的預(yù)處理能顯著提高M(jìn)SN-DOX-PDA-NGR的IC50值,24小時(shí)提高11.7倍,48小時(shí)提高6.1倍。對于BCEC-C6、U251細(xì)胞,各處理組間的IC50值有相同的趨勢;對于GL261細(xì)胞,未發(fā)現(xiàn)各處理組間的IC50值存在顯著差異(P0.05)。在細(xì)胞攝取機(jī)制實(shí)驗(yàn)中,流式細(xì)胞技術(shù)顯示Na N3(能量消耗劑),Cyto-B(大胞飲抑制劑),CPZ(網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑)和莫能菌素(溶酶體抑制劑)組的C6細(xì)胞熒光強(qiáng)度比對照組顯著降低(P0.05),而filipin和genistein(小凹介導(dǎo)的內(nèi)吞抑制劑)以及BFA(高爾基體和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑)組的C6細(xì)胞熒光強(qiáng)度相對于對照組無顯著差異(P0.05);對于BCEC-C6細(xì)胞,僅genistein組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與對照組無顯著差異(P0.05)。激光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了納米粒進(jìn)入細(xì)胞后定位于溶酶體。在體外BBB模型中,孵育12小時(shí)后,MSN-DOX-PDA和MSN-DOX-PDA-NGR的跨BBB轉(zhuǎn)移率分別是13.16%和24.59%,差異有顯著性;預(yù)孵游離NGR后,MSN-DOX-PDA-NGR的跨BBB轉(zhuǎn)移率顯著降低。在體外共培養(yǎng)模型中,流式細(xì)胞技術(shù)顯示MSN-DOX-PDA-NGR與共培養(yǎng)體系中的C6細(xì)胞結(jié)合最多,CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示MSN-DOX-PDA-NGR的毒性最大。結(jié)論載體MSN-PDA-NGR的細(xì)胞毒性作用很小,MSN-DOX-PDA-NGR具有雙靶向C6和BCEC-C6的能力,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第三部分MSN-DOX-PDA-NGR雙靶向性的的體內(nèi)研究目的建立C6膠質(zhì)瘤體內(nèi)模型,尾靜脈注射DOX、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR,研究各種DOX制劑在體內(nèi)重要臟器中的分布情況及抗瘤效果,觀察模型鼠的腫瘤生長情況并計(jì)算生存期,評估體內(nèi)應(yīng)用的生物安全性。方法首先建立裸鼠膠質(zhì)瘤模型,尾靜脈注射各種DOX制劑后,在動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)下于設(shè)定時(shí)間點(diǎn)觀察活體組織及離體臟器各DOX制劑的分布情況。然后用熒光顯微鏡觀察MSN-DOX-PDA及MSN-DOX-PDA-NGR在大鼠膠質(zhì)瘤模型中腦組織及腫瘤組織內(nèi)的分布情況。用HPLC法檢測模型鼠中左右大腦半球及肝臟組織內(nèi)DOX的含量。用HE染色法及免疫組化法觀察雙靶向納米粒的抗腫瘤及抗腫瘤血管的活性,記錄生理鹽水組,DOX組,MSN-DOX-PDA組,MSN-DOX-PDA-NGR組模型鼠的生存時(shí)間。用載體MSN-PDA-NGR注射成年健康雄性大鼠,記錄體重變化,并將主要臟器行HE染色以評估載體的生物安全性。結(jié)果與MSN-DOX-PDA相比,MSN-DOX-PDA-NGR能更多地聚集于腦腫瘤區(qū)域。定量實(shí)驗(yàn)顯示MSN-DOX-PDA-NGR組中荷瘤側(cè)大腦半球的DOX含量顯著高于正常側(cè)大腦半球,而肝臟的DOX含量無顯著差異。HE染色及免疫組化結(jié)果提示MSN-DOX-PDA-NGR組的腫瘤壞死、凋亡面積最大,腫瘤血管數(shù)量顯著減少。生存曲線顯示生理鹽水組、DOX組、MSN-DOX-PDA組、MSN-DOX-PDA-NGR組中大鼠的中位數(shù)生存時(shí)間分別是19天、21天、21.5天、32天。MSN-DOX-PDA-NGR治療能顯著延長中位生存時(shí)間。用載體MSN-PDA-NGR及生理鹽水靜脈注射后,兩組的體重增長情況無明顯差異,HE染色顯示心、肝、脾、肺、腎無明顯的病理性壞死或損傷。結(jié)論MSN-DOX-PDA-NGR能突破血腦屏障分布于腫瘤組織中,并產(chǎn)生明顯的抗腫瘤及抗腫瘤血管活性,具有很好的生物安全性。
[Abstract]:A new type of nano - particle with average particle size of 160nm was prepared by mixing MSN with the solution of poly - dopamine . The results showed that the release rate of the nanoparticles was 160.1 鹵 1.49nm , the surface potential was -22 鹵 0.997 mV . The results showed that the release rate of the nanoparticles was 160.1 鹵 1.49nm , the surface potential was -22 鹵 0.997 mV . The cytotoxic effects of nanoparticles and lysosomes on C6 , BCEC - C6 and U251 cells were evaluated by flow cytometry . The IC50 values of the cells were determined to be 16.90 , 138.1 , 5.09 , 59.71 渭g / ml , respectively . The results showed that there was no significant difference in the cross - BBB transfer rate between the two groups , such as normal saline group , group A - PDA - NGR and MSN - GPDA - NGR . Conclusion : The results showed that there was no significant difference in the cross - BBB transfer rate between the two groups .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1887187