本文選題：microRNA + 膠質瘤　； 參考：《吉林大學》2014年博士論文

【摘要】：本實驗以人膠質瘤組織標本、膠質瘤細胞系以及裸鼠荷瘤模型為研究對象，研究miR-125b在膠質瘤細胞中的表達，，以及其對膠質瘤生物學功能的影響和潛在分子機制。本實驗共分3部分： 1. miR-125b在神經膠質瘤患者外周血和瘤體中的表達及臨床意義 MicroRNA是一類長約18-25nt，非編碼的單鏈小RNA分子，與特定mRNA結合后可在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。研究證實，microRNA與膠質瘤的關系密切。本研究收集我院住院手術膠質瘤患者的瘤組織，提取RNA后經deepsequencing檢測，結果顯示與正常腦組織相比，膠質瘤中約有34種miRNAs水平下調4倍以上，46種miRNAs上調4倍以上。其中，miR-125b在瘤體內上調較為明顯。為進一步對microRNA譜篩選結果進行驗證，我們利用qRT-PCR檢測miR-125b在膠質瘤患者外周血清和瘤體內的表達。結果顯示，膠質瘤患者外周血清和瘤體內miR-125b水平均明顯高于正常成人（p0.01）。為進一步研究miR-125b的臨床意義，我們對膠質瘤標本進行了Ki67評分并研究其與miR-125b表達的相關性，結果顯示miR-125b與Ki67評分呈正相關，并且腫瘤內高miR-125b表達患者腫瘤復發(fā)時間要明顯早于腫瘤內低miR-125b表達的患者。這些結果表明miR-125b在膠質瘤患者體內表達上調，并與腫瘤惡性程度以及疾病預后相關。 2.miR-125b促進膠質瘤細胞的增殖、侵襲及抗凋亡能力 在第一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b與腫瘤惡性程度以及疾病預后相關，但其對膠質瘤生物學功能的影響還待進一步研究。因此，在本研究中，我們在miR-125b對膠質瘤細胞體內外增殖、抗凋亡能力和侵襲性的影響方面做了系統(tǒng)研究。 我們將miR-125b的激動劑agomir-125b和其陰性對照agomir-NC轉染至U87和U251細胞后，每24h進行1次MTT檢測。結果顯示，轉染agomir-NC的U87和U251細胞在各時間段吸光度與對照組相比無明顯差異（p0.05），而轉染了agomir-125b的U87和U251細胞在48h時吸光度明顯高于對照組（p0.01），在72h和96h時高于對照組（p 0.05）。同時我們還進行了細胞克隆形成實驗，結果發(fā)現(xiàn)轉染agomir-125b的U87細胞在體外成克隆數目明顯多于普通對照組（control）和其陰性對照（agomir-NC）（p 0.05），而agomir-NC組與control組相比無明顯差異（p0.05）。為研究miR-125b對膠質瘤細胞侵襲能力的影響，我們進行了細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗。結果顯示，轉染miR-125b的U87細胞的遷移距離明顯長于其陰性對照組（p0.05）。并且，轉染miR-125b的U87細胞穿過基質膠和濾膜的平均數目也明顯多于其陰性對照組（p0.01）。這些結果說明miR-125b可增強膠質瘤細胞的遷移及侵襲能力。為研究miR-125b對膠質瘤細胞抗凋亡能力的影響，我們將替莫唑胺（TMZ）作為腫瘤細胞的凋亡誘導劑，然后通過Hoechst33258染色以及western blot對轉染miR-125b的U87細胞的凋亡情況進行檢測。結果顯示，在TMZ存在情況下，轉染miR-125b的U87細胞凋亡數目明顯少于其陰性對照組（p0.05）。并且western blot檢測結果顯示，轉染miR-125b的U87細胞中兩個凋亡相關蛋白PARP和caspase3表達水平明顯低于陰性對照組（p0.05）。這些結果說明miR-125b可增強膠質瘤細胞對化療藥物刺激的抗凋亡能力。同時，我們還將轉染了agomir-NC、agomir-125b的C6細胞和普通C6細胞（control）分別注射至裸鼠的皮下，連續(xù)測量腫瘤的生長情況。結果發(fā)現(xiàn)，從第5天開始，agomir-125b組的膠質瘤體積明顯大于陰性對照組（p0.05）。此結果說明agomir-125b可促進在體膠質瘤細胞成瘤和生長。 以上結果顯示miR-125b具有促進膠質瘤細胞生長、成瘤、侵襲和抗凋亡的作用，具有重要的研究意義，但其具體作用機制還待進一步研究。 3.miR-125b通過抑制靶點Cx43表達發(fā)揮對膠質瘤生物學特性的影響 為研究miR-125b影響膠質瘤生物學特性的機制，我們通過miRbase、Targetscan和microRNA.org三種軟件預測miR-125b的作用靶點，結果發(fā)現(xiàn)Cx43mRNA的3’UTR端包含一個7mer大小的序列與miR-125b相匹配。為了確定這些序列與miR-125b結合后可下調Cx43mRNA的翻譯，我們將含此位點的Cx43mRNA3’UTR構建入luciferase報告系統(tǒng)（Cx43-3’UTR-wt），同時將突變后的Cx43mRNA3’UTR也插入luciferase報告系統(tǒng)中（Cx43-3’UTR-mut）。然后將miR-125b與luciferase空質粒（empty vector）或Cx43-3’UTR-wt質粒或Cx43-3’UTR-mut質粒共同轉染至HEK-293細胞中，檢測各組細胞中的熒光強度。并且，我們將miR-125bmimic及其陰性對照mimic-NC、miR-125b inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC轉染至U87細胞中，western blot檢測Cx43水平。結果發(fā)現(xiàn)Cx43-3’UTR-wt組熒光強度明顯低于其陰性對照組（miR-con），而Cx43-3’UTR-mut組或空質粒組熒光強度與其陰性對照無明顯差異；miR-125b mimic可顯著降低U87細胞中Cx43水平（p0.05），而miR-125b inhibitor可顯著升高U87細胞中Cx43水平（p 0.05）。 為確定Cx43是否參與了miR-125b對膠質瘤細胞生物學行為的改變作用，我們還構建了過表達Cx43的U87膠質瘤細胞，進一步研究miR-125b對過表達Cx43的U87細胞生物學行為的影響。結果發(fā)現(xiàn)，同時轉染miR-125b，Cx43過表達U87細胞形成克隆的能力明顯低于其陰性對照（p0.05）。并且Cx43過表達U87細胞抗TMZ誘導凋亡的能力均明顯低于其陰性對照（p0.05）。 此結果表明miR-125b可以通過與Cx43mRNA3’UTR端結合而調節(jié)其蛋白表達水平，過表達Cx43可阻斷miR-125b對神經膠質瘤細胞生長和抗凋亡能力的影響，證明其參與了miR-125b改變膠質瘤細胞生物學行為的作用。
[Abstract]:In this experiment , human glioma tissue samples , glioma cell lines and nude mice bearing tumor models were used as the research objects to study the expression of miR - 125 in glioma cells , as well as their effects on the biological function of glioma and potential molecular mechanisms .

Expression and Clinical Significance of the Expression of 1 . miR - 5 in Peripheral Blood and Tumor of Patients with glioma

MicroRNA was a kind of single - stranded small RNA molecule of about 18 - 25nt , which was non - coding single - stranded small RNA molecule , and can regulate the expression of gene at post - transcriptional level after binding with specific mRNA .

2 . The proliferation , invasion and anti - apoptotic ability of glioma cells

In the first part of the study , we have found that the effects of miR - 125 on the biological function of glioma have to be further studied . Therefore , in the present study , we have done a systematic study on the effects of miR - 125 on the proliferation , anti - apoptotic ability and invasion ability of glioma cell bodies .

The results showed that U87 and U251 cells transfected with agomir - NC showed no significant difference compared with the control group ( p < 0.05 ) , and the absorbance of U87 and U251 cells transfected with agomir - NC was significantly higher than that of the control group at 48 hours ( p < 0.05 ) . The results showed that the expression level of the U87 cells transfected with miR - 125 was significantly lower than that of the negative control group ( P < 0.05 ) .

The above results show that miR - 812has the function of promoting glioma cell growth , tumor formation , invasion and anti - apoptosis , and has important research significance , but the specific mechanism of action is further studied .

3 . The effect on the biological characteristics of glioma by inhibiting the expression of Cx43 in the target

In order to determine the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC , we detected the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC .
The level of Cx43 in U87 cells was significantly decreased ( p < 0.05 ) , while the level of Cx43 in U87 cells was significantly increased ( p 0.05 ) .

In order to determine whether Cx43 was involved in the biological behavior of human glioma cells , we also constructed U87 glioma cells expressing Cx43 , and further studied the effect of miR - 12s on the biological behavior of U87 cells expressing Cx43 .

The results show that miR - 125 can regulate the protein expression level of glioma cells by binding to the terminal of Cx43mRNA3 ' , and the overexpression of Cx43 can block the influence of miR - 12s on the growth and anti - apoptotic ability of glioma cells . It is shown that it is involved in the biological behavior of glioma cells .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：1874764