本文選題：microRNA + 膠質(zhì)瘤��； 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：本實驗以人膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及裸鼠荷瘤模型為研究對象，研究miR-125b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，，以及其對膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響和潛在分子機(jī)制。本實驗共分3部分： 1. miR-125b在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者外周血和瘤體中的表達(dá)及臨床意義 MicroRNA是一類長約18-25nt，非編碼的單鏈小RNA分子，與特定mRNA結(jié)合后可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究證實，microRNA與膠質(zhì)瘤的關(guān)系密切。本研究收集我院住院手術(shù)膠質(zhì)瘤患者的瘤組織，提取RNA后經(jīng)deepsequencing檢測，結(jié)果顯示與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中約有34種miRNAs水平下調(diào)4倍以上，46種miRNAs上調(diào)4倍以上。其中，miR-125b在瘤體內(nèi)上調(diào)較為明顯。為進(jìn)一步對microRNA譜篩選結(jié)果進(jìn)行驗證，我們利用qRT-PCR檢測miR-125b在膠質(zhì)瘤患者外周血清和瘤體內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤患者外周血清和瘤體內(nèi)miR-125b水平均明顯高于正常成人（p0.01）。為進(jìn)一步研究miR-125b的臨床意義，我們對膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行了Ki67評分并研究其與miR-125b表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-125b與Ki67評分呈正相關(guān)，并且腫瘤內(nèi)高miR-125b表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)時間要明顯早于腫瘤內(nèi)低miR-125b表達(dá)的患者。這些結(jié)果表明miR-125b在膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤惡性程度以及疾病預(yù)后相關(guān)。 2.miR-125b促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及抗凋亡能力 在第一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-125b與腫瘤惡性程度以及疾病預(yù)后相關(guān)，但其對膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響還待進(jìn)一步研究。因此，在本研究中，我們在miR-125b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外增殖、抗凋亡能力和侵襲性的影響方面做了系統(tǒng)研究。 我們將miR-125b的激動劑agomir-125b和其陰性對照agomir-NC轉(zhuǎn)染至U87和U251細(xì)胞后，每24h進(jìn)行1次MTT檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染agomir-NC的U87和U251細(xì)胞在各時間段吸光度與對照組相比無明顯差異（p0.05），而轉(zhuǎn)染了agomir-125b的U87和U251細(xì)胞在48h時吸光度明顯高于對照組（p0.01），在72h和96h時高于對照組（p 0.05）。同時我們還進(jìn)行了細(xì)胞克隆形成實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染agomir-125b的U87細(xì)胞在體外成克隆數(shù)目明顯多于普通對照組（control）和其陰性對照（agomir-NC）（p 0.05），而agomir-NC組與control組相比無明顯差異（p0.05）。為研究miR-125b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b的U87細(xì)胞的遷移距離明顯長于其陰性對照組（p0.05）。并且，轉(zhuǎn)染miR-125b的U87細(xì)胞穿過基質(zhì)膠和濾膜的平均數(shù)目也明顯多于其陰性對照組（p0.01）。這些結(jié)果說明miR-125b可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。為研究miR-125b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗凋亡能力的影響，我們將替莫唑胺（TMZ）作為腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)劑，然后通過Hoechst33258染色以及western blot對轉(zhuǎn)染miR-125b的U87細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在TMZ存在情況下，轉(zhuǎn)染miR-125b的U87細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯少于其陰性對照組（p0.05）。并且western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b的U87細(xì)胞中兩個凋亡相關(guān)蛋白PARP和caspase3表達(dá)水平明顯低于陰性對照組（p0.05）。這些結(jié)果說明miR-125b可增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物刺激的抗凋亡能力。同時，我們還將轉(zhuǎn)染了agomir-NC、agomir-125b的C6細(xì)胞和普通C6細(xì)胞（control）分別注射至裸鼠的皮下，連續(xù)測量腫瘤的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從第5天開始，agomir-125b組的膠質(zhì)瘤體積明顯大于陰性對照組（p0.05）。此結(jié)果說明agomir-125b可促進(jìn)在體膠質(zhì)瘤細(xì)胞成瘤和生長。 以上結(jié)果顯示miR-125b具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、成瘤、侵襲和抗凋亡的作用，具有重要的研究意義，但其具體作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究。 3.miR-125b通過抑制靶點Cx43表達(dá)發(fā)揮對膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的影響 為研究miR-125b影響膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的機(jī)制，我們通過miRbase、Targetscan和microRNA.org三種軟件預(yù)測miR-125b的作用靶點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cx43mRNA的3’UTR端包含一個7mer大小的序列與miR-125b相匹配。為了確定這些序列與miR-125b結(jié)合后可下調(diào)Cx43mRNA的翻譯，我們將含此位點的Cx43mRNA3’UTR構(gòu)建入luciferase報告系統(tǒng)（Cx43-3’UTR-wt），同時將突變后的Cx43mRNA3’UTR也插入luciferase報告系統(tǒng)中（Cx43-3’UTR-mut）。然后將miR-125b與luciferase空質(zhì)粒（empty vector）或Cx43-3’UTR-wt質(zhì)�；駽x43-3’UTR-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中，檢測各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。并且，我們將miR-125bmimic及其陰性對照mimic-NC、miR-125b inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，western blot檢測Cx43水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cx43-3’UTR-wt組熒光強(qiáng)度明顯低于其陰性對照組（miR-con），而Cx43-3’UTR-mut組或空質(zhì)粒組熒光強(qiáng)度與其陰性對照無明顯差異；miR-125b mimic可顯著降低U87細(xì)胞中Cx43水平（p0.05），而miR-125b inhibitor可顯著升高U87細(xì)胞中Cx43水平（p 0.05）。 為確定Cx43是否參與了miR-125b對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變作用，我們還構(gòu)建了過表達(dá)Cx43的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，進(jìn)一步研究miR-125b對過表達(dá)Cx43的U87細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時轉(zhuǎn)染miR-125b，Cx43過表達(dá)U87細(xì)胞形成克隆的能力明顯低于其陰性對照（p0.05）。并且Cx43過表達(dá)U87細(xì)胞抗TMZ誘導(dǎo)凋亡的能力均明顯低于其陰性對照（p0.05）。 此結(jié)果表明miR-125b可以通過與Cx43mRNA3’UTR端結(jié)合而調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)水平，過表達(dá)Cx43可阻斷miR-125b對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和抗凋亡能力的影響，證明其參與了miR-125b改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。
[Abstract]:In this experiment , human glioma tissue samples , glioma cell lines and nude mice bearing tumor models were used as the research objects to study the expression of miR - 125 in glioma cells , as well as their effects on the biological function of glioma and potential molecular mechanisms .

Expression and Clinical Significance of the Expression of 1 . miR - 5 in Peripheral Blood and Tumor of Patients with glioma

MicroRNA was a kind of single - stranded small RNA molecule of about 18 - 25nt , which was non - coding single - stranded small RNA molecule , and can regulate the expression of gene at post - transcriptional level after binding with specific mRNA .

2 . The proliferation , invasion and anti - apoptotic ability of glioma cells

In the first part of the study , we have found that the effects of miR - 125 on the biological function of glioma have to be further studied . Therefore , in the present study , we have done a systematic study on the effects of miR - 125 on the proliferation , anti - apoptotic ability and invasion ability of glioma cell bodies .

The results showed that U87 and U251 cells transfected with agomir - NC showed no significant difference compared with the control group ( p < 0.05 ) , and the absorbance of U87 and U251 cells transfected with agomir - NC was significantly higher than that of the control group at 48 hours ( p < 0.05 ) . The results showed that the expression level of the U87 cells transfected with miR - 125 was significantly lower than that of the negative control group ( P < 0.05 ) .

The above results show that miR - 812has the function of promoting glioma cell growth , tumor formation , invasion and anti - apoptosis , and has important research significance , but the specific mechanism of action is further studied .

3 . The effect on the biological characteristics of glioma by inhibiting the expression of Cx43 in the target

In order to determine the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC , we detected the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC .
The level of Cx43 in U87 cells was significantly decreased ( p < 0.05 ) , while the level of Cx43 in U87 cells was significantly increased ( p 0.05 ) .

In order to determine whether Cx43 was involved in the biological behavior of human glioma cells , we also constructed U87 glioma cells expressing Cx43 , and further studied the effect of miR - 12s on the biological behavior of U87 cells expressing Cx43 .

The results show that miR - 125 can regulate the protein expression level of glioma cells by binding to the terminal of Cx43mRNA3 ' , and the overexpression of Cx43 can block the influence of miR - 12s on the growth and anti - apoptotic ability of glioma cells . It is shown that it is involved in the biological behavior of glioma cells .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：1874764