本文選題：腦膠質(zhì)瘤 + SENP1�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的：檢測SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)在正常組織及不同級別星型膠質(zhì)瘤組織中的表達情況，分析其表達水平與病情進展的關聯(lián)，采用RNA干擾技術在膠質(zhì)瘤細胞株U87MG中敲低SENP1的表達，研究其對U87MG細胞增殖和凋亡的影響及可能的分子調(diào)控機制。 方法：采用RT-qPCR和Western blotting方法檢測SENP1在正常對照（3例）及星形細胞膠質(zhì)瘤（28例）標本中mRNA水平和蛋白水平的表達差異。設計并合成特異性針對SENP1基因的siRNA，按照2.5×105個/孔、體積2ml接種U87MG細胞于6孔板中，12h后轉(zhuǎn)染si-NC(對照組)、si-1、 si-2(敲低SENP1組)，待細胞融合度達90%以上后，使用Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)轉(zhuǎn)染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用RT-qPCR和Western blotting方法檢測SENP1的mRNA和蛋白表達情況。同時在膠質(zhì)瘤細胞株U87MG沉默SENP1后應用AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶(PI)雙染色法在流式細胞儀上通過檢測細胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS)評估凋亡細胞的數(shù)量。最后，，在U87MG細胞中敲低SENP1，通過蛋白印跡實驗檢測胞內(nèi)IκBα、p38的蛋白表達情況和二者的磷酸化水平，以及通路下游靶因子p65和bcl-2蛋白水平的表達情況。 結(jié)果：通過qPCR檢測收集的31例腦組織標本中發(fā)現(xiàn)：與正常腦組織相比，人腦星型膠質(zhì)瘤中SENP1的mRNA表達水平明顯升高(P0.05)，其隨著腫瘤惡性程度的增高而增高，在高級別星形細胞膠質(zhì)瘤(Ⅲ,Ⅳ級,WHO)中增高的水平更為顯著(P0.01)；通過蛋白印跡實驗從蛋白水平檢測SENP1在正常組織和不同級別之間蛋白水平的差異，結(jié)果顯示其與mRNA水平類似。轉(zhuǎn)染SENP1siRNA后，U87MG細胞SENP1mRNA表達受到抑制(P0.01)，蛋白表達水平降低。通過細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，與si-NC(對照組)相比、轉(zhuǎn)染si-1、si-2(敲低SENP1組)的U87MG細胞，其凋亡明顯增加，凋亡率統(tǒng)計學分析與對照組相比顯著增加（P0.05）。在U87MG細胞中敲低SENP1，通過蛋白印跡實驗檢測分析IκBα、p65和bcl-2在蛋白水平的表達情況，發(fā)現(xiàn)IκBα蛋白在兩種細胞株中的表達水平無變化，與對照組相比，IκBα的磷酸化水平明顯降低且其下游靶因子p65和抗凋亡蛋白bcl-2的表達亦隨之降低，而在U87MG細胞中敲低SENP1后檢測p38MAPK通路的激活情況，p38的磷酸化水平?jīng)]有發(fā)生明顯的變化。 結(jié)論： 1SENP1在腦膠質(zhì)瘤標本中的表達差異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，可以作為臨床監(jiān)測和評價預后的重要指標。 2SENP1可以通過調(diào)控NF-κB通路介導的抗凋亡途徑，即通過調(diào)控IκBα蛋白的磷酸化水平，影響其下游基因p65、bcl-2的表達，進而調(diào)節(jié)U87MG細胞的增殖或凋亡，從而進一步揭示了SENP1在促進癌癥發(fā)生發(fā)展過程中可能的新的分子生物學機制。
[Abstract]:Objective: to detect the expression of SUMO specific protease 1 (SENP1) in normal tissue and different grade Astroglioma tissues, and to analyze the relationship between the expression level and the progression of the disease. The expression of SENP1 in the glioma cell line U87MG was knocked out by RNA interference technique, and the effect of the expression on the proliferation and apoptosis of U87MG cells and the possible molecules were studied. Regulation mechanism.
Methods: RT-qPCR and Western blotting were used to detect the difference in the expression of mRNA and protein levels in normal control (3 cases) and astrocytoma (28 cases). The specific siRNA of the SENP1 gene was designed and synthesized. The U87MG cells were inoculated in the 6 hole plate according to the 2.5 x 105 / pores, and the volume 2ml was transfected to si-NC (control group) after 12h. ), SI-1, Si-2 (knocking low SENP1 group), after cell fusion was over 90%, Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA) transfected cells and 48h were continued. RT-qPCR and Western blotting methods were used to detect SENP1 mRNA and protein expression. In flow cytometry, the number of apoptotic cells was evaluated by detecting phosphatidylserine (PS) on the cell surface. Finally, SENP1 was knocked down in U87MG cells. The protein expression of intracellular I kappa B alpha, p38 and the level of phosphorylation of the two persons were detected by Western blot, and the expression of the target factor p65 and bcl-2 protein level in the downstream pathway was expressed. Situation.
Results: in 31 specimens of brain tissue collected by qPCR, it was found that the level of mRNA expression of SENP1 in human Astroglioma was significantly higher than normal brain tissue (P0.05), which increased with the increase of tumor malignancy, and increased significantly in advanced astrocytoma (grade III, grade IV, WHO) (P0.01). The difference in protein level between normal tissue and different levels of SENP1 was detected from protein level by Western blot. The results showed that the protein level was similar to that of mRNA. After transfection of SENP1siRNA, the expression of SENP1mRNA in U87MG cells was inhibited (P0.01) and protein expression level decreased. The transfection of SI-1, compared with si-NC (control group), was found through apoptosis analysis. The apoptosis of U87MG cells in the group of Si-2 (group SENP1) increased significantly and the apoptosis rate was significantly increased (P0.05) compared with the control group. The expression of I kappa B a, p65 and Bcl-2 in the protein level was detected in U87MG cells, and the expression level of I kappa B alpha protein in the two cell lines was not changed. Compared with the control group, the phosphorylation level of I kappa B alpha was obviously decreased and the target factor p65 and the expression of anti apoptotic protein Bcl-2 were also decreased, and the activation of p38MAPK pathway was detected after the low SENP1 in U87MG cells, and there was no significant change in the phosphorylation level of p38.
Conclusion:
The difference of expression of 1SENP1 in glioma specimens is closely related to the occurrence and development of tumors. It can be used as an important indicator for clinical monitoring and prognosis.
2SENP1 can regulate the anti apoptosis pathway mediated by NF- kappa B pathway, that is, by regulating the phosphorylation level of I kappa B alpha protein, affecting the expression of the downstream gene p65, Bcl-2, and then regulating the proliferation or apoptosis of U87MG cells, thus further revealing the possible new molecular biological mechanism of SENP1 in the process of promoting the development of cancer.

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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