本文選題：帕金森病 + SH-SY5Y　； 參考：《中國科學(xué)院北京基因組研究所》2014年博士論文

【摘要】：一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物體內(nèi)一種活潑的氮氧自由基分子。內(nèi)源性NO應(yīng)力可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基發(fā)生亞硝基化修飾,這種修飾影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,由此參與調(diào)節(jié)血管平滑肌伸縮、神經(jīng)信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物過程。帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一類嚴(yán)重危害中老年人群的神經(jīng)退行性疾病。在PD病患的腦組織中廣泛存在NO應(yīng)力升高和蛋白質(zhì)氧化修飾增強(qiáng)的現(xiàn)象。一般認(rèn)為,NO應(yīng)力與PD中多巴胺神經(jīng)元的凋亡過程相關(guān),但是分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究選擇了一種廣泛接受的PD多巴胺神經(jīng)元凋亡研究模型,即魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡；考察了該模型在正常和PD兩種狀態(tài)下,NO應(yīng)力的改變和蛋白質(zhì)亞硝基化修飾狀態(tài)的改變；探索了亞硝基化可能影響SH-SY5Y細(xì)胞凋亡通路變化的分子機(jī)制。采用多方位的細(xì)胞行為和生物化學(xué)性質(zhì)檢測,我們發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的NO水平與魚藤酮濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān),而且魚藤酮處理后的細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡表型。我們建立了一種生物素置換標(biāo)記與差異凝膠電泳相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)方法(CyDye switch/2D-DIGE),力圖全面跟蹤SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞硝基化的狀態(tài)改變。CyDye switch/2D-DIGE方法能夠避免傳統(tǒng)技術(shù)中巰基亞硝基化標(biāo)記不穩(wěn)定的缺點(diǎn),也具備較高的通量篩選亞硝基化的差異蛋白質(zhì)。比較魚藤酮處理后SH-SY5Y細(xì)胞的CyDye switch/2D-DIGE圖譜,我們發(fā)現(xiàn)了213個(gè)熒光斑點(diǎn),其中7個(gè)斑點(diǎn)的光密度強(qiáng)度在魚藤酮處理后增強(qiáng)1.5倍以上。將差異斑點(diǎn)的胰蛋白酶消化產(chǎn)物送至生物質(zhì)譜檢測,結(jié)果表明,這些蛋白質(zhì)的功能迥異,但大多被報(bào)道與巰基亞硝基修飾相關(guān)。在所有上調(diào)的亞硝基化修飾蛋白質(zhì)中,增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)是一個(gè)廣為報(bào)道的與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)分子。一般認(rèn)為,細(xì)胞核內(nèi)PCNA通過影響DNA復(fù)制和修復(fù)來調(diào)控細(xì)胞凋亡；然而在SH-SY5Y中,我們觀察到PCNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,而不是在細(xì)胞核內(nèi)。這促使我們追問,細(xì)胞質(zhì)PCNA的亞硝基化是否與該模型的凋亡相關(guān)?通過SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)PCNA互作蛋白質(zhì)組的分析,PCNA被證實(shí)與半胱天冬蛋白酶-9 (caspase9)有較為強(qiáng)烈的相互作用,而后者恰好是細(xì)胞質(zhì)中凋亡信號通路的啟動分子之一。利用高精度質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),PCNA存在兩個(gè)亞硝基化位點(diǎn),Cys81和Cys162。利用蛋白質(zhì)的定點(diǎn)突變和pull-down實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步揭示,Cys81的亞硝基化顯著降低了PCNA口caspase9之間的相互作用。在caspas e9的剪切激活實(shí)驗(yàn)中,PCNA的相互作用可抑制caspase9的自剪切過程,但是亞硝基化的PCNA失去了這種抑制作用。生物信息學(xué)分析還表明,PCNA的Cys81亞硝基化可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,而PCNA的Cys162亞硝基化并不影響空間構(gòu)型。因此,我們推論,PCNA/caspase9的相互作用可能發(fā)生在PCNA的Cys81附近的區(qū)域,這樣該位點(diǎn)的修飾才能對相互作用發(fā)揮顯著影響。在本研究中,我們提出了NO應(yīng)力影響PD多巴胺神經(jīng)元凋亡的一種新型分子調(diào)節(jié)機(jī)制。在PD細(xì)胞凋亡研究模型中,魚藤酮誘導(dǎo)引發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞中NO應(yīng)力增高,NO則進(jìn)一步廣泛地引起修飾蛋白質(zhì)亞硝基化修飾。SH-SY5Y胞質(zhì)中的PCNA是一個(gè)NO攻擊的重要蛋白質(zhì)之一,其亞硝基修飾的位點(diǎn)主要集中在Cys81。該位點(diǎn)的亞硝基化修飾造成了PCNA構(gòu)型變化,弱化了PCNA與caspase9間相互作用,從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡通路的活化。
[Abstract]:Nitric oxide ( NO ) is an active nitrogen - oxygen free radical molecule in the organism . The endogenous NO stress can induce the alteration of cysteine residues in the protein . This modification affects the spatial structure and biological activity of the protein . Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease which is seriously harmful to the middle - aged and old people . The Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease which seriously endangers the middle - aged and old people .
The change of NO stress and the modification of the modification state of protein were investigated under both normal and PD conditions .
CyDye switch / 2D - DIGE method was used to detect the changes of intracellular protein in SH - SYY cells . CyDye switch / 2D - DIGE method was used to detect the changes of protein in SH - SYY cells .
In this study , the interaction between PCNA and caspase - 9 ( caspase9 ) could be inhibited by the interaction between PCNA and caspase - 9 ( caspase9 ) .

【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5;R-332

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本文編號：1805694