本文選題：斑馬魚 + 多巴胺神經(jīng)元�。� 參考：《成都醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,發(fā)病與黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性死亡有關(guān),確切機(jī)制不清。文獻(xiàn)報(bào)道,氧化應(yīng)激在帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。白藜蘆醇(trans-3,4',5-trihydroxystilbene,RE)是一種存在于多種植物中的天然物質(zhì),具有抗氧化損傷與抑制炎癥反應(yīng)的作用,對帕金森病是否具有預(yù)防治療作用尚未明確。因此,本研究旨在觀察白藜蘆醇對MPTP致PD斑馬魚的神經(jīng)元保護(hù)作用,并探討其作用的可能機(jī)制。目的研究白藜蘆醇對PD斑馬魚多巴胺神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用,并初步探討其作用的機(jī)制。白藜蘆醇是一種天然多芬物質(zhì)存在于葡萄、花生、桑葚和虎杖中,因其具有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗局部缺血的生物特性,已受到醫(yī)學(xué)研究的青睞[1]。帕金森病是由中腦黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元變性壞死,造成紋狀體內(nèi)多巴胺含減少量而造成的[2]。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)可導(dǎo)致斑馬魚多巴胺神經(jīng)元減少,PD斑馬魚尾巴彎曲、游泳行為改變,PD相關(guān)基因表達(dá)下降等類似帕金森病的表現(xiàn)[3]。白藜蘆醇對MPTP誘導(dǎo)的帕金森病斑馬魚多巴胺神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用引起了我們的興趣。本研究以MPTP處理的斑馬魚作為帕金森病動(dòng)物模型,研究白藜蘆醇對帕金森病斑馬魚多巴胺神經(jīng)元的影響及其作用機(jī)制。方法斑馬魚飼養(yǎng)采用大型自動(dòng)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng),自動(dòng)光照-黑暗比為14h/10h,實(shí)驗(yàn)采用野生型AB品系斑馬魚及Tg(vmat2:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚,每日投食三次,于晚間投食后選取親魚交配,次日收集胚胎放于28.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待斑馬魚培養(yǎng)至72小時(shí)后將斑馬魚轉(zhuǎn)移至六孔板內(nèi)待用。實(shí)驗(yàn)分為五組:1)空白對照組(con組);2)200 u M/m L MPTP處理組(MPTP組);3)60 u M/m L白藜蘆醇處理組(RE組);4)先加60 u Mm/L RE,12 h后加200 um MPTP/m L組(MR1組);5)先加200 u M/m L MPTP,12 h后加60u M/m L RE組(M1R組)。各組在發(fā)育至第四天時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。激光共聚焦顯微鏡觀察Tg(vmat2:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚多巴胺神經(jīng)元和野生型AB品系斑馬魚TH免疫熒光。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測PD相關(guān)基因parkin、pink1、dj-1和凋亡相關(guān)基因bax、p21、bcl2及抗氧化基因sod、cat、ho-1表達(dá)水平。TUNEL染色法觀察斑馬魚腦部細(xì)胞凋亡。免疫印跡法檢測NRF2的表達(dá)水平。結(jié)果1.MPTP處理后野生型斑馬魚出現(xiàn)尾巴彎曲,游泳行為減少,游泳速度減慢,轉(zhuǎn)彎增多,在六孔板中斑馬魚游至孔周邊的現(xiàn)象,并且出現(xiàn)心率減慢,每分鐘約40次(空白對照組約每分鐘80次),M1R和MR1組尾部彎曲得到了緩解,游泳行為、速度等得到一定程度恢復(fù),心率減慢得到緩解。2.Tg(vmat2:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚,MPTP處理后,多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少,熒光亮度減低,并有部分區(qū)域缺失。M1R和MR1組斑馬魚多巴胺神經(jīng)元減少程度較MPTP組輕,熒光亮度亦有增強(qiáng),初步說明白藜蘆醇可保護(hù)斑馬魚多巴胺神經(jīng)元。3.在野生型斑馬魚中,TH免疫熒光結(jié)果顯示,MPTP可導(dǎo)致TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少,熒光強(qiáng)度減弱,M1R和MR1組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少較MPTP組有所緩解,熒光強(qiáng)度亦見回升。藥物加入的先后順序?qū)υ搶?shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,MPTP處理組,PD相關(guān)基因表達(dá)水平下調(diào),尤其是parkin和dj-1下降明顯,M1R和MR1組表達(dá)量回升,說明白藜蘆醇可保護(hù)PD相關(guān)基因,保護(hù)線粒體;抗氧化基因cat、sod和ho-1在MPTP組表達(dá)下降,加入白藜蘆醇后(M1R組和MR1組)表達(dá)回升,說明白藜蘆醇保護(hù)多巴胺神經(jīng)元可能是通過影響體內(nèi)氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的;MPTP組凋亡相關(guān)基因bax、p21表達(dá)上升,bcl2表達(dá)下降,M1R和MR1組其表達(dá)量部分恢復(fù)。5.TUNEL染色結(jié)果顯示MPTP處理斑馬魚后,斑馬魚頭部細(xì)胞凋亡明顯增加,多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少,繼加入白藜蘆醇后凋亡數(shù)量較MPTP組減少,M1R組和MR1組沒有明顯的差異,白藜蘆醇單獨(dú)處理組和對照組細(xì)胞凋亡無明顯差異,說明白藜蘆醇對斑馬魚無毒性作用,并可保護(hù)多巴胺神經(jīng)元。6.免疫印跡結(jié)果顯示,MPTP處理組NRF2蛋白表達(dá)明顯下降,加入白藜蘆醇后,表達(dá)量回升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白藜蘆醇單獨(dú)處理也可激活NRF2的表達(dá)。M1R和MR1組表達(dá)量差異不明顯。表明白藜蘆醇的保護(hù)作用可通過影響NRF2/ARE信號途徑來實(shí)現(xiàn)。結(jié)論1.MPTP誘導(dǎo)的PD斑馬魚模型構(gòu)建成功,白藜蘆醇減輕MPTP毒性的同時(shí)其自身不會(huì)對斑馬魚造成損傷。2.MPTP處理后轉(zhuǎn)基因斑馬魚間腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元減少,加入白藜蘆醇后上述現(xiàn)象得到一定程度緩解,初步說明白藜蘆醇可保護(hù)斑馬魚多巴胺神經(jīng)元;TH抗體整胚免疫組化顯示,白藜蘆醇可減輕TH陽性神經(jīng)元的丟失,進(jìn)一步說明白藜蘆醇可保護(hù)斑馬魚多巴胺神經(jīng)元。3.白藜蘆醇可調(diào)節(jié)PD相關(guān)基因、凋亡相關(guān)基因和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá),從而保護(hù)多巴胺神經(jīng)元,表明白藜蘆醇的保護(hù)作用可通過抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)。4.白藜蘆醇可減輕因MPTP造成的細(xì)胞凋亡。5.白藜蘆醇保護(hù)多巴胺神經(jīng)元可通過影響NRF2/ARE信號通路來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Parkinson ' s disease ( PD ) is a common degenerative disease of the central nervous system . The pathogenesis of Parkinson ' s disease is related to the selective and progressive death of dopaminergic neurons . It has been reported that it plays an important role in the development of Parkinson ' s disease . Parkinson ' s disease is caused by degeneration and necrosis of dopamine neurons in the nigra of mesencephalon , resulting in degeneration of dopamine in the striatum . In our previous experiments , MPTP ( 1 - methyl - 4 - phenyl - 1,2,3,6 - tetrahydropyridine , MPTP ) could lead to the reduction of dopaminergic neurons in zebrafish , the changes of the tail of PD zebra fish , the change of swimming behavior , and the decrease of PD - related gene expression . The effects of resveratrol on the dopaminergic neurons of Parkinson ' s disease ( MPTP ) induced by MPTP were studied . The effects of resveratrol on the dopaminergic neurons in Parkinson ' s disease were studied . The results showed that there was no significant difference in the number of neurons in MPTP treated group and M1R group and MR1 group . The results showed that resveratrol could protect the dopaminergic neurons of zebrafish .

【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

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本文編號：1793321