發(fā)布時(shí)間：2018-04-22 06:07

  本文選題：NLRP3炎性小體 + 2型糖尿病�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的NLRP3炎性小體是大分子蛋白復(fù)合體,能夠識(shí)別多種危險(xiǎn)刺激信號(hào),募集并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,casepase-1),進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的釋放,是機(jī)體固有免疫的一部分。目前研究發(fā)現(xiàn)炎性小體在多種炎性相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用,如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病、自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、再灌注損傷等。2型糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要包括認(rèn)知障礙和腦血管管疾病。以往研究表明NLRP3炎性小體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切,但是炎性小體在2型糖尿病腦微血管的損傷中是否起作用,及作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠腦組織中NLRP3的分布,及高糖處理小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白,來(lái)探討NLRP3炎性小體在高糖作用下的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的變化及變化機(jī)制。方法(1)飼養(yǎng)6月齡雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,自發(fā)性2型糖尿病(goto-kakizaki,GK)大鼠作為實(shí)驗(yàn)組,每組各5只,采用免疫組織化學(xué)方法觀察腦組織中NLRP3的表達(dá)及空間分布。(2)體外培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基模擬體內(nèi)2型糖尿病內(nèi)環(huán)境,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為抑制劑,將細(xì)胞分為對(duì)照組(培養(yǎng)基糖濃度5.6mmol/L)、高糖1組(HG1組,培養(yǎng)基糖濃度1Ommol/L)、高糖2組(HG2組,培養(yǎng)基糖濃度20mmol/L)、高糖3組(HG3組,培養(yǎng)基糖濃度30mmol/L)及高糖+NAC組(HG +NAC組,目的蛋白表達(dá)較明顯組的糖濃度組內(nèi)按照1:1000預(yù)先加入NAC)。(3)采用Western blotting法檢測(cè)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞各組硫氧還蛋白交互蛋白(TXNIP)和NLRP3的表達(dá),采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中的IL-1 β的水平;采取流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估對(duì)照組、HG3組、HG+NAC組ROS的含量。(4)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所得數(shù)據(jù)以x±s表示,兩組間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn),多組間的比較應(yīng)用單因素方差分析。所得P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)NLRP3主要分布于GK大鼠腦皮層及皮層下組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微/小血管管壁。與Wistar大鼠相比,GK大鼠的陽(yáng)染強(qiáng)度,陽(yáng)染血管數(shù)均有增加(P0.05);(2)與對(duì)照組相比,HG1組、HG2組、HG3組TXNIP、NLRP3的表達(dá)有所增加(P0.01),尤以HG3組蛋白表達(dá)增加最明顯。(3)與對(duì)照組相比,HG1組、HG2組、HG3組細(xì)胞內(nèi)IL-1 β水平有所增高(P0.01)。(4)與對(duì)照組相比,HG3組ROS的含量增加(P0.01);給予ROS清除劑后,與HG3組相比,HG+NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS含量下降(P0.01),TXNIP、NLRP3表達(dá)水平下降(p0.01),細(xì)胞內(nèi)IL-Iβ水平下降(P0.01)。結(jié)論(1)高糖可促進(jìn)NLRP3和TXNIP的蛋白表達(dá),并隨糖濃度的增加而表達(dá)增高。(2)高糖各組IL-Iβ的水平含量增加,說(shuō)明NLRP3炎性體被激活。(3)高糖可導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多ROS。給予ROS清除劑后,高糖組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量下降,且細(xì)胞內(nèi)的TXNIP和NLRP3的蛋白表達(dá)、IL-1β的水平均下降,說(shuō)明高糖可以通過(guò)與ROS相關(guān)的途徑活化NLRP3炎性小體。(4)據(jù)此,我們推測(cè)NLRP3炎性小體在2型糖尿病腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中可經(jīng)高糖-ROS-TXNIP途徑被活化,參與2型糖尿病腦微血管的損傷。
[Abstract]:Objective NLRP3 inflammatory corpuscle is a large molecular protein complex that recognizes a variety of dangerous stimulus signals and raises and activates -1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, casepase-1) containing cysteine, and further promotes the inflammatory factor of interleukin -1 beta (interleukin-1 beta, IL-1 beta) and interleukin -18 (Interleukin-18) (Interleukin-18). The release of IL-18 is part of the body's inherent immunity. Current studies have found that inflammatory corpuscles play an important role in a variety of inflammatory related diseases, such as diabetic nephropathy, retinopathy, autoimmune diseases, atherosclerosis, reperfusion injury and other central nervous system injuries, including cognitive impairment and brain. Vascular diseases. Previous studies have shown that NLRP3 inflammatory corpuscles are closely related to central nervous system diseases, but the role and mechanism of inflammatory corpuscles in the brain microvascular injury of type 2 diabetes are not clear. This experiment was conducted by observing the distribution of NLRP3 in the brain tissue of rats and the high glucose treatment of the microvascular endothelial cells in the brain of mice. The changes and changes of NLRP3 inflammatory corpuscles in the cerebral microvascular endothelial cells under the action of high glucose were investigated. Methods (1) 6 month old male Wistar rats were fed as experimental control group, and spontaneous type 2 diabetes (Goto-Kakizaki, GK) rats were used as experimental group, and 5 rats in each group were observed by immunohistochemical method. The expression and spatial distribution of NLRP3 in the tissue. (2) the mouse brain microvascular endothelial cells were cultured in vitro. Different glucose concentration medium was used to simulate the internal environment of type 2 diabetes in the body. The active oxygen (Reactive Oxygen Species, ROS) scavenger N- acetylcysteine (NAC) was used as the inhibitor, and the cells were divided into the control group (culture medium sugar concentration 5.6mmol/L) and high sugar 1. Group (group HG1, glucose concentration 1Ommol/L), 2 groups of high sugar (group HG2, culture medium sugar concentration 20mmol/L), high sugar 3 groups (HG3 group, medium sugar concentration 30mmol/L) and high glucose +NAC group (HG +NAC group, the sugar concentration group of the target protein expression group was pre added into NAC) in the sugar concentration group. (3) the mouse brain microvascular endothelial cells were detected by Western assay The expression of thioredoxin interaction protein (TXNIP) and NLRP3 and the level of IL-1 beta in the cells of each group were detected by ELISA. Flow cytometry was used to evaluate the content of ROS in the control group, HG3 group and HG+NAC group. (4) the data were analyzed with SPSS19.0 statistics software, and the data were expressed in X + s, and the two groups were compared to t check. The results of P0.05 were statistically significant. Results (1) NLRP3 was mainly distributed in the neuroglia cells and microvascular wall of subcortical tissues of GK rats. Compared with Wistar rats, the positive intensity of GK rats increased (P0.05); (2) compared with the control group, the number of positive cells increased (P0.05). The expression of TXNIP in group HG1, group HG2 and HG3 increased (P0.01), especially in HG3 histone expression. (3) the level of IL-1 beta in HG1, HG2 and HG3 groups increased (P0.01) in comparison with the control group (P0.01). (4) compared with the control group, the content of the group increased. Content decreased (P0.01), TXNIP, NLRP3 expression level decreased (P0.01), IL-I beta level decreased (P0.01). Conclusion (1) high sugar can promote the protein expression of NLRP3 and TXNIP, and increase with the increase of sugar concentration. (2) the level of IL-I beta in high sugar groups increases, indicating that NLRP3 inflammatory bodies are activated. (3) high glucose can lead to microvascular endothelium finely. The content of ROS in the cells of high glucose decreased, and the protein expression of TXNIP and NLRP3 in the cells decreased, and the level of IL-1 beta in the cells decreased, indicating that the high glucose could activate the NLRP3 inflammatory corpuscle in the ROS related pathway. (4) according to this, we speculate that the NLRP3 inflammatory corpuscle is in the cerebral microvascular endothelial cells of type 2 diabetes. It can be activated by high glucose -ROS-TXNIP pathway and participate in cerebral microvascular damage in type 2 diabetes.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R747.9

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本文編號(hào)：1785923