發(fā)布時(shí)間：2018-04-21 22:35

  本文選題：凝血酶 + 腦水腫��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種嚴(yán)重的致死、致殘性疾病。在北美、歐洲以及澳大利亞,腦出血占所有卒中類型的10 15%;而在亞洲,該比例則高達(dá)20 30%;全世界每年報(bào)道的新發(fā)腦出血病例更是高達(dá)200,000例。腦出血病人第一個(gè)月的死亡率高達(dá)30-50%,目前腦出血仍缺乏有效的治療措施,且存活下來的病人也留下不同程度的神經(jīng)功能障礙。腦水腫(Brain edema)是腦出血之后一種重要的繼發(fā)性損傷。腦水腫導(dǎo)致腦出血后占位效應(yīng)和顱內(nèi)壓增加,并直接損傷腦組織和導(dǎo)致最終腦疝的發(fā)生;腦水腫也可以直接通過滲透壓改變引起神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毒性,也能直接破壞血腦屏障(blood brain barrier,BBB)。多種因素包括凝血因子的細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生,其中,凝血酶是介導(dǎo)腦出血后早期腦水腫形成的重要機(jī)制,凝血酶抑制劑阿加曲班或水蛭素能減輕實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血后腦水腫。向大鼠側(cè)尾殼核區(qū)注入凝血酶能在幾小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)腦水腫的快速形成,且水腫在1-3天內(nèi)達(dá)到高峰,在隨后幾周內(nèi)逐漸緩解,并且腦水腫的嚴(yán)重程度和血腦屏障的通透性是一致的。凝血酶能激活大腦細(xì)胞內(nèi)多種分子信號(hào)通路,而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是其中最常見的一種。根據(jù)Xi等文獻(xiàn)報(bào)道,向大鼠基底節(jié)區(qū)注入凝血酶后,該信號(hào)通路被激活,表明該通路與腦水腫的發(fā)生存在密切相關(guān)。內(nèi)源性大麻素受體系統(tǒng)(endocannabinoid system,e CBs),包括內(nèi)源性大麻素受體、內(nèi)源性大麻素配體以及內(nèi)源性降解酶,該系統(tǒng)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中常作為重要的藥物治療靶點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的大麻素受體包括兩種,即大麻素1型受體(Cannabinoid receptor type 1,CB1R)和大麻素2型受體(Cannabinoid receptor type 2,CB2R)。具有致精神興奮作用的大麻素1型受體主要表達(dá)在神經(jīng)元上,同時(shí)由于該受體的精神作用,限制其藥物開發(fā)潛力,因此,發(fā)掘CB2R激動(dòng)劑的治療作用更具實(shí)際臨床意義。CB2R主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上,主要有抗炎、免疫細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及抗原提成作用。CB2R的抗炎神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)在多種動(dòng)物模型包括多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)、阿爾茨海默癥(Alzheimer’sdisease,AD)中得到研究證實(shí)。課題組前期研究已證實(shí),選擇性CB2R激動(dòng)劑JWH133能減輕幼鼠生發(fā)基質(zhì)出血(germinal matrix hemorrhage)模型的腦水腫,但具體機(jī)制尚不清楚。因此推測(cè),選擇性CB2R激動(dòng)劑JWH133對(duì)凝血酶所致的腦水腫同樣有干預(yù)作用。本課題在凝血酶注入大鼠右側(cè)基底節(jié)后,采用CB2R激動(dòng)劑JWH133進(jìn)行干預(yù),觀察JWH133對(duì)大鼠腦水腫的干預(yù)效應(yīng)并進(jìn)一步探索其涉及的具體機(jī)制。分兩部分研究驗(yàn)證上述推測(cè):第一部分在凝血酶注入后,檢測(cè)大鼠腦組織含水量變化情況以及血腦屏障的損傷情況,第二部分在凝血酶注入后,給予選擇性CB2R激動(dòng)劑JWH133干預(yù),觀察JWH133對(duì)凝血酶所致腦水腫的干預(yù)效應(yīng)并探討其可能涉及的具體機(jī)制。一、凝血酶致大鼠腦水腫及血腦屏障損傷的作用研究目的在凝血酶注入大鼠右側(cè)基底節(jié)后24h,檢測(cè)大鼠腦組織含水量變化情況以及血腦屏障的損傷情況。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為生理鹽水組(Saline)和凝血酶組(Thrombin),生理鹽水組將5u生理鹽水注入大鼠右側(cè)基底節(jié),凝血酶組將5u(20U)凝血酶(Sigma)溶液注入大鼠右側(cè)基底節(jié)。術(shù)后24h用干濕重法測(cè)量腦組織含水量及伊文斯藍(lán)滲出實(shí)驗(yàn)評(píng)估血腦屏障完整性,采用免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況及Western blot法檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)情況。結(jié)果1.凝血酶溶液注入大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)后24h,腦組織含水量與生理鹽水組相比顯著上升(p0.01),2.凝血酶溶液注入大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)后24h,凝血酶損傷區(qū)域附近的伊文斯藍(lán)滲出量較生理鹽水組顯著增加(p0.05),表明血腦屏障損傷明顯,3.免疫熒光結(jié)果顯示凝血酶注入后基底節(jié)區(qū)Iba-1陽性的的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較生理鹽水組明顯增加(p0.05),Western blot結(jié)果顯示凝血酶注入后金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)情況均較生理鹽水組明顯增加(p0.05)。因此推測(cè):小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)上調(diào)可能參與了凝血酶導(dǎo)致的腦水腫及血腦屏障損傷過程。結(jié)論本部分研究觀察了凝血酶注入后24h腦含水量、伊文斯藍(lán)滲出量變化情況以及小膠質(zhì)細(xì)胞活化、金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠凝血酶注入后存在明顯的腦水腫以及血腦屏障損傷,且小膠質(zhì)細(xì)胞活化、金屬基質(zhì)蛋白酶9表達(dá)上調(diào)可能與腦水腫形成及血腦屏障的損傷過程相關(guān)。二、大麻素2型受體激動(dòng)劑JWH133對(duì)大鼠凝血酶所致腦水腫的干預(yù)效應(yīng)及機(jī)制研究目的觀察CB2R活化對(duì)凝血酶所致大鼠腦水腫的干預(yù)效應(yīng),并進(jìn)一步探討其涉及的具體機(jī)制。方法本部分實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham)、凝血酶+溶劑干預(yù)組(Vehicle)、凝血酶+JWH133干預(yù)組(JWH)、凝血酶+SR144528+JWH133干預(yù)組(SR+JWH)。首先,Sham組僅進(jìn)針;然后選擇適宜的JWH133給藥時(shí)間,JWH組在凝血酶注入基底節(jié)后1h給予JWH133腹腔注射(1.5 mg/kg)治療;Vehicle組同時(shí)給予相應(yīng)劑量的溶劑腹腔注射;JWH133特異性阻斷劑SR144528(3mg/kg)于JWH133注射前3min提前腹腔注射。所有動(dòng)物于建模型后24h取標(biāo)本,采用干濕重法測(cè)腦水含量和熒光顯微鏡/分光光度計(jì)觀察檢測(cè)伊文斯藍(lán)滲出情況,免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、ERK信號(hào)通路和緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)情況。western blot法檢測(cè)ERK信號(hào)通路、金屬基質(zhì)蛋白酶9/12和緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)情況。結(jié)果1.與Vehicle組相比較,JWH133干預(yù)后顯著減輕大鼠凝血酶所致的腦含水量和伊文斯藍(lán)滲出量(p0.05),2.免疫熒光顯示凝血酶注入后磷酸化的ERK信號(hào)通路與Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞共標(biāo),且與Vehicle組相比較,JWH13干預(yù)后JWH組磷酸化的ERK信號(hào)通路表達(dá)量較Vehicle組降低(p0.05),3.與Vehicle組相比較,金屬基質(zhì)蛋白酶9/12在JWH133干預(yù)后表達(dá)較Vehicle組下調(diào)(p0.05),同時(shí)緊密連接蛋白ZO-1在JWH133干預(yù)后表達(dá)較Vehicle組增加(p0.05)。以上干預(yù)作用,在同時(shí)給予JWH133特異性抑制劑SR144528之后被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論在大鼠凝血酶所致腦水腫后,給予CB2R激動(dòng)劑JWH133干預(yù)能減輕凝血酶所致腦水腫,其機(jī)制可能與抑制ERK信號(hào)通路磷酸化,進(jìn)一步降低細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶9/12分解和增加緊密蛋白表達(dá)相關(guān),從而發(fā)揮保護(hù)血腦屏障、減輕腦水腫的作用。CB2R激動(dòng)有望成為腦出血后腦水腫治療的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:鑴戝嚭琛，

本文編號(hào)：1784397