本文選題：synphilin-1　切入點(diǎn)：釀酒酵母　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：帕金森氏癥是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,該疾病的典型特征之一是神經(jīng)細(xì)胞中蛋白內(nèi)含體的形成。Synphilin-1蛋白是帕金森氏癥蛋白內(nèi)含體的主要組分之一,與其他帕金森氏癥病理相關(guān)蛋白之間存在相互作用,暗示著synphilin-1蛋白的聚集在帕金森氏內(nèi)含體的形成中起重要作用。然而,由于在人體以及哺乳動(dòng)物體內(nèi)研究該蛋白聚集物形成過(guò)程的限制性以及基因組的復(fù)雜性,synphilin-1蛋白聚集物形成的分子機(jī)理尚不明確。細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集的過(guò)程和生物學(xué)途徑在真核生物中是高度保守的,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存在大量人類同源基因,且該模型存在諸多優(yōu)勢(shì),因此,本課題利用釀酒酵母模型,以synphilin-1蛋白聚集物作為研究對(duì)象,采用基因組水平的酵母高通量圖像篩選方法,結(jié)合合成遺傳陣列(Synthetic genetic array)技術(shù),篩選得到對(duì)synphilin-1蛋白聚集物形成產(chǎn)生影響的基因。再通過(guò)生物信息學(xué)方法,構(gòu)建與其相互作用基因的網(wǎng)絡(luò)譜圖,考察這些基因所涉及的功能復(fù)合體或生物學(xué)途徑,探索釀酒酵母細(xì)胞中synphilin-1蛋白聚集物形成的分子機(jī)理。為了從基因組水平探索影響synphilin-1蛋白聚集物形成的基因,本課題首先通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化法,獲得異源表達(dá)synphilin-1蛋白的質(zhì)詢菌株(Query strain)Y7092-285。以該質(zhì)詢菌株為基礎(chǔ),運(yùn)用合成遺傳陣列技術(shù)構(gòu)建得到表達(dá)融合有紅色熒光標(biāo)簽的synphilin-1蛋白的釀酒酵母單基因突變菌株庫(kù),命名為S2YDSY1。通過(guò)對(duì)S2YDSY1庫(kù)中菌株的生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定,并進(jìn)行比較篩選,得到57株呈現(xiàn)顯著生長(zhǎng)缺陷狀態(tài)的突變菌株。對(duì)篩選得到的57個(gè)抑制synphilin-1誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的基因進(jìn)行功能富集(Functional enrichment)分析,發(fā)現(xiàn)這些基因所在功能組主要涉及細(xì)胞骨架運(yùn)輸途徑、膜質(zhì)生物合成,THO復(fù)合體以及Prefoldin蛋白復(fù)合體。然后,結(jié)合基因組水平的酵母高通量圖像技術(shù),開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種針對(duì)熒光蛋白標(biāo)記的synphilin-1蛋白聚集物的高通量篩選方法,篩選得到133個(gè)促進(jìn)synphilin-1蛋白聚集物形成的基因。對(duì)影響synphilin-1蛋白聚集物的基因和功能組進(jìn)行探討,表明了細(xì)胞骨架組織、組蛋白修飾,姊妹染色單體分離、糖脂生物合成途徑和DNA復(fù)制途徑參與了synphilin-1蛋白聚集物的形成。為了進(jìn)一步明確篩選得到基因與synphilin-1蛋白聚集物形成的聯(lián)系,對(duì)synphilin-1蛋白聚集物形成篩選和生長(zhǎng)合成缺陷(Synthetic sick)篩選重疊基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)DYN3,GIM4,KAR3,NUM1,PAC10,SHE4,YKE2,VAC14,ACT1,GPI19基因在釀酒酵母中促進(jìn)了synphilin-1蛋白聚集物的形成,并抑制了synphilin-1蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性;結(jié)論支持了“成熟聚集物的形成是一系列事件的末期,可能對(duì)細(xì)胞機(jī)體具有一定的保護(hù)效應(yīng)”的假設(shè)。且GIM4,KAR3,PAC10,SHE4,YKE2,VAC14,ACT1基因都存在人類同源基因,這也為后續(xù)在人模型中進(jìn)一步研究synphilin-1聚集物的形成以及帕金森氏癥病理提供一個(gè)突破點(diǎn)。利用細(xì)胞染色和免疫熒光等方法,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)synphilin-1蛋白聚集物與線粒體結(jié)構(gòu)和肌動(dòng)蛋白骨架共定位,且synphilin-1聚集物形成后即積累于胞內(nèi)近核質(zhì)量控制區(qū)域,也存在于液泡附近的外周質(zhì)量控制區(qū)域內(nèi),因此認(rèn)為在酵母細(xì)胞中synphilin-1蛋白聚集物的形成是一種附著于線粒體,以肌動(dòng)蛋白為主的固定和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,且組蛋白的修飾和糖脂生物合成途徑對(duì)該聚集起促進(jìn)作用。在釀酒酵母模型中對(duì)synphilin-1蛋白聚集物形成分子機(jī)理的研究,闡明了影響該蛋白聚集物形成的基因和功能組,為后續(xù)在人類細(xì)胞或者動(dòng)物模型中研究synphilin-1蛋白聚集物形成以及毒性奠定了基礎(chǔ),并為進(jìn)一步理解帕金森氏癥的病理提供理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：1723402