發(fā)布時間：2018-04-03 21:56

  本文選題：核仁素　切入點：端粒　出處：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤(glioma)是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的原發(fā)腫瘤,其特點為惡性程度高,預后差,手術(shù)治療存在復發(fā)風險性,對化療治療具有一定耐藥性。研究表明,膠質(zhì)瘤細胞存在端粒酶和核仁素(nucleolin,NCL)的過表達現(xiàn)象,并且成為了膠質(zhì)瘤各種惡性特征和治療抵抗的基礎(chǔ)。核仁素普遍存在于真核細胞中,調(diào)控核糖體聚集、DNA代謝和RNA表達等生物活動。核仁素調(diào)控m RNA的轉(zhuǎn)錄的特性是控制細胞生物活動的主要作用。核仁素由707個氨基酸殘基組成,主要含有三個主要的功能結(jié)構(gòu)域,主要為羧基端、氨基端和中心區(qū)。氨基酸調(diào)控c DNA轉(zhuǎn)錄,核糖體前體包裝,中心區(qū)含有4個較為保守的、序列一致型RNA結(jié)合域(RNA-Binding Domain,RBD),羧基端富含甘氨酸殘基,可以使RNA更容易接近中心區(qū)的RNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)。核仁素的RBD具有特異性結(jié)合一系列m RNA的能力。包括Bcl-2,p53等調(diào)控細胞凋亡的蛋白。AS1411是一種富含26個單位的核酸配適體,目前被用于臨床II期實驗進行腫瘤治療實驗。其具有富有鳥嘌呤(G)結(jié)構(gòu)的序列,具有易于吸收且不被核酶降解等優(yōu)點,因此具有治療腫瘤的潛能。端粒(telomere)位于染色體末端,端粒酶可保護端粒酶的降解因而具有保護染色體的作用。目前有報道證實AS1411可以競爭性結(jié)合核仁素的RBD,因此具有可以干擾核仁素調(diào)節(jié)蛋白的能力。三氧化二砷(As2O3)是一種古老的藥物,俗稱砒霜,我國自古就有應用砒霜等含砷的中藥來治療多種頑固疾病如哮喘等等,近年來被逐漸應用于腫瘤的治療。As2O3可以抑制端粒酶從而產(chǎn)生對細胞的生物學效應。目前在膠質(zhì)瘤中靶向干擾核仁素和端粒酶抑制對細胞生長抑制目前少有報道。但由于二者在惡性膠質(zhì)瘤細胞中的高表達現(xiàn)象,因此我們選擇分別利用AS1411干擾核仁素功能,As2O3抑制端粒酶活性,進而探索這兩種藥物通過作用兩個關(guān)鍵蛋白而起到的膠質(zhì)瘤細胞殺傷作用。最后,由于核仁素也可以調(diào)控端粒酶的表達,因此我們進一步探討AS1411對核仁素的干擾進而造成端粒酶抑制等現(xiàn)象。在本文中,我們使用膠質(zhì)瘤細胞系,膠質(zhì)瘤組織,正常腦組織,星形膠質(zhì)細胞以及膠質(zhì)瘤種植小鼠作為實驗對象,主要應用MTT,端粒酶活性TRAP assay,免疫印跡(western blot),免疫熒光,染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP),si RNA基因沉默,Real time-RT-PCR,流式細胞術(shù),衰老染色以及端粒熒光原位雜交分析等技術(shù)探究AS1411對核仁素的干擾,As2O3對端粒酶的抑制,進而造成相應的細胞凋亡,細胞周期阻滯,細胞衰老以及這些現(xiàn)象發(fā)生的主要機制。我們的主要實驗結(jié)果如下:(1)AS1411可以通過與核仁素的RBD區(qū)域競爭性結(jié)合,上調(diào)p53以及下調(diào)Bcl-2和Akt1的表達。AS1411通過干擾核仁素上調(diào)p53和下調(diào)Bcl-2導致細胞的早期凋亡,AS1411通過下調(diào)Akt1抑制了膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。(2)核仁素在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細胞中都過表達。AS1411通過干擾核仁素造成膠質(zhì)瘤細胞的生長抑制,同時AS1411作用的體內(nèi)實驗顯著減小了腫瘤的體積和延長了膠質(zhì)瘤種植小鼠的生存期。(3)As2O3在膠質(zhì)瘤細胞中產(chǎn)生了活性氧,因而造成了端粒酶的核質(zhì)轉(zhuǎn)移以及端粒酶磷酸化,進而造成了端粒酶活性抑制。(4)端粒酶的活性抑制造成的發(fā)生在染色體端粒部分的DNA損傷,并造成了ATM和ATR依賴途徑的損傷應答。(5)As2O3誘導了膠質(zhì)瘤細胞染色體末端融合,進一步研究發(fā)現(xiàn),As2O3對腦膠質(zhì)瘤端粒的3’懸端長度造成變化,出現(xiàn)融合縮短。(6)發(fā)生在端粒結(jié)構(gòu)的DNA損傷又發(fā)了細胞凋亡,G2/M周期阻滯和細胞衰老現(xiàn)象的發(fā)生。(7)核仁素RBD的干擾導致了端粒酶活性的抑制,進而造成了細胞衰老等現(xiàn)象。結(jié)論:本文率先證實了在膠質(zhì)瘤細胞中,AS1411靶向干擾核仁素可以造成p53的上調(diào),Bcl-2和Akt1下調(diào)。利用As2O3抑制端粒酶活性可以造成ATM依賴的DNA損傷,進而引起膠質(zhì)瘤細胞生長抑制,以及細胞凋亡,細胞損傷,周期阻滯,侵襲和遷移能力的抑制等等。
[Abstract]:Glioma (glioma) is a neurological primary tumor is common, characterized by high malignancy and poor prognosis, surgical treatment has the risk of recurrence, has a certain resistance to chemotherapy in the treatment of glioma cells. The study shows that the existence of telomerase and nucleolin (nucleolin, NCL) over expression of the phenomenon, and become the resistance of various malignant glioma characteristics and therapy. Nucleolin exists widely in eukaryotic cells, regulation of ribosome aggregation, DNA metabolism and the expression of RNA and other biological activities. The characteristics of transcriptional regulation of M nucleolin RNA is the main control cell biological activities. Nucleolin is composed of 707 amino acid residues, the main there are three major functional domains, mainly for the carboxyl terminal amino terminal, and the central region. The amino acid regulation of C DNA transcription, ribosomal precursor packaging, central area contains 4 of the more conservative sequence type RNA binding domain (RNA-B Inding Domain, RBD), carboxyl terminal glycine rich residues, can make the RNA more accessible to the central area of the RNA binding domain structure. Nucleolin RBD has a specific binding ability. A series of M RNA including Bcl-2, p53, cell apoptosis protein.AS1411 is a rich 26 single bit with nucleic acid aptamers, currently being used in phase II clinical trials in tumor treatment experiments. It has rich guanine (G) structure of the sequence is easy to absorb and not by ribozyme degradation. Thus, it has the potential for tumor treatment. Telomere (telomere) located on chromosome end, which can protect the degradation of telomerase telomerase have a protective effect on chromosome. There are reports indicating that AS1411 can compete with nucleolin RBD, so it can interfere with nucleolin regulated protein ability. Arsenic trioxide (As2O3) is a kind of ancient medicine, commonly known as arsenic, China There are ancient Chinese medicine containing arsenic arsenic to treat many kinds of stubborn diseases such as asthma and so on, in recent years has been gradually applied in the treatment of tumor.As2O3 can inhibit telomerase to produce biological effects on cells. At present in glioma targeting nucleolin and telomerase inhibition on cell growth inhibition was rarely reported. But because of the two in malignant glioma cells in high expression, so we choose respectively by AS1411 interference of nucleolin As2O3 function, inhibition of telomerase activity of glioma cells, and to explore the role of the two drugs through two key proteins and the killing effect. Finally, the expression of nucleolin can also regulate telomerase, therefore we further explore the AS1411 of nucleolin interference caused by telomerase inhibition phenomenon. In this paper, we use the glioma cell lines and glioma tissues, normal Brain tissue, astrocytes and glioma implant mice as experimental objects, the main application of MTT, the telomerase activity in TRAP assay, immunoblotting (Western blot), immunofluorescence, chromatin immunoprecipitation (Ch IP), Si RNA Real time-RT-PCR, gene silencing, flow cytometry, aging telomere staining and fluorescence in situ hybridization analysis these techniques explore AS1411 on nucleolin interference, inhibition of As2O3 on telomerase, resulting in cell apoptosis related, cell cycle arrest, cell senescence and the main mechanism of these phenomena. Our main results are as follows: (1) AS1411 can be combined by the RBD regional competition and nucleolin, upregulation of p53 and the expression of.AS1411 and down-regulation of Bcl-2 by Akt1 interference of nucleolin upregulation of p53 and downregulation of Bcl-2 apoptosis, AS1411 inhibits glioma cell invasion and metastasis through down-regulation of Akt1. (2) nuclear The kernel in glioma tissues and glioma cells in.AS1411 overexpression by interfering with nucleolin caused by glioma cell growth inhibition, and in vivo effect of AS1411 significantly reduced the tumor volume and prolong the survival time of the mice planting glioma. (3) As2O3 produced active oxygen in glioma cells. Thus telomerase and telomerase nuclear transfer phosphorylation, thus resulting in the inhibition of telomerase activity. (4) the activity of telomerase inhibition caused by DNA damage occurs in the part of the telomere, and caused ATM damage response and ATR dependent pathways. (5) As2O3 induced glioma cell chromosome end fusion, further study found that As2O3 on glioma telomere 3 'end length changes caused by suspension, the integration is shortened. (6) occurred in the DNA damage of telomere was cell cycle arrest and cell apoptosis, G2/M. Old phenomenon. (7) interference nucleolin RBD leads to inhibition of telomerase activity, thus resulting in the phenomenon of cell aging. Conclusions: This paper first confirmed in glioma cells, AS1411 targeting nucleolin can cause the upregulation of p53, Bcl-2 and Akt1. Downregulation of As2O3 can inhibit telomerase activity caused by ATM dependent DNA damage, thereby causing glioma cell growth inhibition, cell apoptosis and cell cycle arrest, injury, invasion and migration inhibition and so on.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1707065