本文選題：腦缺血再灌注損傷　切入點(diǎn)：高遷移率族蛋白B1　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：缺血性腦卒中是發(fā)病率和致殘率最高的疾病之一。缺血區(qū)血管可因再通而發(fā)生腦缺血再灌注損傷(CIRI)。CIRI誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)和外周免疫系統(tǒng)抑制(SIID,以淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,功能抑制為主要特征,其誘導(dǎo)感染發(fā)生率增高)雙向效應(yīng),目前治療手段有限。CIRI后,壞死神經(jīng)元釋放高遷移率蛋白B1(HMGB1),其是一種細(xì)胞因子樣蛋白,在CIRI病理過程中發(fā)揮重要作用。前人研究表明CIRI后,小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及T細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤于缺血區(qū),參與腦組織炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實(shí),HMGB1的致炎效應(yīng),可通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞而發(fā)揮和傳遞。HMGB1是否同時(shí)作用于浸潤的T細(xì)胞,甚至因T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞有交互作用而通過T細(xì)胞再間接作用于巨噬細(xì)胞,目前還不清楚。不僅如此,CIRI后,HMGB1尚可通過破損的血腦屏障進(jìn)入腦脊液甚至外周血。前人研究報(bào)導(dǎo),大劑量HMGB1可通過作用于樹突狀細(xì)胞(DCs)或者直接作用于T細(xì)胞,誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫功能抑制,而腦卒中后大量入血的HMGB1,是否與外周淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能改變有關(guān),是否介導(dǎo)SIID的發(fā)生,目前尚無研究報(bào)導(dǎo)。 研究目的：擬采用局灶性腦缺血再灌注損傷模型,應(yīng)用HMGB1抑制劑Glycyrrhizin(甘草甜素),觀察CIRI后,HMGB1在缺血腦組織中的定位和表達(dá)情況,腦組織炎癥反應(yīng)情況,以及外周器官中T細(xì)胞數(shù)量改變,同時(shí)采用T細(xì)胞缺陷動(dòng)物,離體和在體觀察T細(xì)胞缺陷,對HMGB1效應(yīng)的影響及二者的相關(guān)性,旨在探討HMGB1在CIRI誘導(dǎo)的腦組織炎癥反應(yīng)和外周免疫抑制中的效應(yīng)及機(jī)制,為腦卒中的治療和預(yù)后提供新靶標(biāo)。 研究方法：本研究首先采用野生型Sprague Dawley (SD)大鼠及CD57BL/6J小鼠,建立大腦中動(dòng)脈短暫性阻塞的局灶性腦缺血再灌注損傷模型(MCAO),于再灌注后12、48及72小時(shí),免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察HMGB1在缺血腦組織、局部神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的定位、表達(dá)情況。而后,于動(dòng)物腹腔在MCAO再灌注后即刻及3.5小時(shí)各注射一次Glycyrrhizin,TTC染色法觀察大鼠腦梗塞體積,免疫熒光染色法檢測缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤情況,以及流式細(xì)胞儀檢測缺血大腦半球單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞型CD4+、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量,以探討HMGB1對CIRI腦組織炎癥和腦損傷的效應(yīng)及機(jī)制。然后,采用野生型SD大鼠及T細(xì)胞缺陷的裸大鼠,在短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷(MCAO)及永久性電凝大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端的永久性局灶性腦缺血再灌注損傷(dMCAO)兩種模型中,以及CD57BL/6J野生型小鼠及T、B聯(lián)合缺陷的SCID小鼠MCAO模型中,以Glycyrrhizin抑制IMGB1, TTC染色法檢測再灌注72小時(shí)后,動(dòng)物腦梗塞體積,探討T細(xì)胞缺陷對HMGB1腦損傷效應(yīng)的影響；接著,將來源于野生型小鼠的脾細(xì)胞,過繼回輸給SCID小鼠,在有無Glycyrrhizin處理之下,觀察腦梗塞體積變化,反向驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)；另外,離體將來源于野生型與SCID小鼠的脾細(xì)胞,在刀豆蛋白A (ConA)刺激后,與神經(jīng)元共培養(yǎng),CCK-8試劑盒檢測HMGB1有無被Glycyrrhizin抑制下,神經(jīng)元的存活率,觀察脾細(xì)胞對神經(jīng)元的殺傷效應(yīng),進(jìn)一步驗(yàn)證和支持T細(xì)胞缺陷對HMGB1作用的影響。接下來,采用Western-blot和ELISA分別檢測MCAO后24小時(shí)腦脊液,以及MCAO后5、24、48小時(shí)血清中HMGB1水平以及Glycyrrhizin的效應(yīng),同時(shí)采用流式細(xì)胞儀,檢測HMGB1有無被Glycyrrhizin抑制下,外周血和脾臟中單個(gè)核細(xì)胞總數(shù),以及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞型CD4+、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量,以探討外周血高水平釋放的HMGB1,與外周器官淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的相關(guān)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、免疫熒光染色顯示HMGB1早在小鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)后12小時(shí)即從神經(jīng)元胞核轉(zhuǎn)移到胞漿,48小時(shí)釋放至胞外同時(shí)伴NeuN+神經(jīng)元數(shù)量減少；與此同時(shí),CIRI后24小時(shí)WB檢測到腦脊液和ELISA檢測到血漿HMGB1高水平表達(dá)；2、免疫熒光顯示CIRI后72小時(shí)腦缺血核心區(qū)CD68+小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞及MPO+中性粒細(xì)胞浸潤增多,而且浸潤的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞亦表達(dá)HMGB1;3、應(yīng)用HMGB1抑制劑Glycyrrhizin,TTC染色顯示野生型大鼠腦梗塞體積減小,免疫熒光顯示腦損傷核心區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量減少,NeuN+神經(jīng)元數(shù)量增多,HMGB1轉(zhuǎn)位和胞外釋放減輕；4、流式檢測顯示缺血再灌注后腦損傷側(cè)包括T細(xì)胞,CD4+、CD8+T細(xì)胞,NK, NKT及B細(xì)胞淋巴細(xì)胞數(shù)量增多,而Glycyrrhizin抑制淋巴細(xì)胞及其亞型浸潤于缺血區(qū)；5、TTC顯示Glycyrrhizin減小MCAO及dMCAO野生型SD大鼠以及MCAO C57小鼠腦梗塞體積,但在T細(xì)胞缺陷裸大鼠及T、B聯(lián)合缺陷SCID小鼠中,其腦保護(hù)作用喪失；但SCID小鼠接受WT小鼠脾細(xì)胞過繼回輸,其增大的腦梗塞體積,又可因Glycyrrhizin抑制HMGB1而減小離體在WT或SCID小鼠的脾細(xì)胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)體系中,Glycyrrhizin改善WT而非SCID小鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡；6、Western-blot顯示大鼠MCAO24小時(shí),腦脊液HMGB1表達(dá)增高；ELISA顯示MCAO后5小時(shí),血清HMGB1水平即升高,24小時(shí)達(dá)到高峰,48小時(shí)仍持續(xù)高水平表達(dá),Glycyrrhizin顯著降低腦脊液及血清HMGB1表達(dá)水平；7、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示與CIRI后缺血腦組織炎癥反應(yīng)加劇以及外周血釋放的HMGB1水平升高相反,MCAO48小時(shí),外周血及脾臟單個(gè)核細(xì)胞總數(shù),T淋巴細(xì)胞,CD4+、CD8+T細(xì)胞,以及B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,而Glycyrrhizin抑制血清高水平HMGB1釋放的同時(shí),顯著改善淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少。 結(jié)論： 1.HMGB1主要分布于正常神經(jīng)元細(xì)胞核中,CIRI誘導(dǎo)HMGB1向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位,并于細(xì)胞死亡后釋放入腦脊液及外周血； 2. HMGB1可能通過雙向效應(yīng),一方面活化浸潤于腦組織的T細(xì)胞,介導(dǎo)缺血再灌注損傷后腦組織局部炎癥反應(yīng),另一方面,通過誘導(dǎo)外周T細(xì)胞免疫功能抑制,介導(dǎo)SIID; 3. Glycyrrhizin將HMGB1作為靶標(biāo),既減輕CIRI腦組織炎癥反應(yīng),又改善外周免疫抑制,從而治療腦卒中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙林;豐昀;;左旋精氨酸甲酯對腦缺血再灌注期腦組織炎癥反應(yīng)的影響[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年03期

2 倪光夏;石學(xué)敏;王占奎;王淑蘭;張新昌;程瑩瑩;;針刺對缺血再灌注大鼠腦組織炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J];江蘇中醫(yī)藥;2012年12期

3 傅科鋒;;依達(dá)拉奉治療急性腦出血臨床療效觀察[J];中國初級衛(wèi)生保健;2012年11期

4 閻榮衛(wèi),李光海;水蛭的臨床研究[J];新疆中醫(yī)藥;1989年04期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前1條

1 葉菡洋;袁偉杰;張志強(qiáng);于建平;傅鵬;梅小斌;郭云珊;崔若蘭;;大豆蛋白飲食對5／6腎切除大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會腎臟病學(xué)分會2006年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 徐峰;肺炎鏈球菌和不可分型流感嗜血桿菌致人肺組織炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2007年

2 熊曉星;HMGB1對腦卒中誘導(dǎo)的腦組織炎癥反應(yīng)和外周免疫抑制的效應(yīng)及機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2014年

，

本文編號：1691733