本文選題：慢性偏頭痛　切入點：PTEN　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的偏頭痛是神經(jīng)內(nèi)科中最多見的可致殘疾病中的一種，可以嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，發(fā)作期處于感覺超敏狀態(tài)，以自發(fā)痛(spontaneous pain)、痛覺過敏(hyperakesia)及觸誘發(fā)痛(allodynia)為特點。而慢性偏頭痛一般由發(fā)作性偏頭痛經(jīng)過數(shù)月到數(shù)年發(fā)展而成，其病理性進(jìn)展可以通過中樞致敏(central sensitization)來解釋，電生理學(xué)和影像學(xué)的研究表明，慢性偏頭痛的發(fā)生與腦干進(jìn)行性的異常變化有關(guān)。目前很多研究表明，慢性偏頭痛中樞高敏感性由NMDAR-NOS-NO介導(dǎo)。 N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體的一種類型，屬于離子型受體，，其廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對神經(jīng)元信號的傳遞和基因表達(dá)的調(diào)控起著重要作用，還是突觸可塑性及皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元長時程增強效應(yīng)的主要調(diào)控者。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B共7種亞單位組成的異四聚體，其中NR1是功能亞單位，NR2和NR3是調(diào)節(jié)亞單。NR2亞單位包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D四種，其中NR2B受體亞型在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成和慢性偏頭痛形成等方面均有重要作用。由于NMDAR通道活性由蛋白激酶和磷酸化介導(dǎo)，所以慢性偏頭痛的維持很可能是由腦干三叉神經(jīng)尾核中NR2B的磷酸化來介導(dǎo)。 NO是在偏頭痛發(fā)作時起關(guān)鍵性作用的一種媒介分子，可以使三叉神經(jīng)系統(tǒng)各個水平的神經(jīng)元活化，包括腦干中的三叉神經(jīng)脊束核。NO體內(nèi)供體包括鈣／鈣調(diào)蛋白依賴的結(jié)構(gòu)型NOS(eNOS，nNOS)以及不依賴Ca的誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS．iNOS）。在硬腦膜上滴入外源性NO供體硝酸甘油，可以引起大鼠三叉神經(jīng)脊束核的神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)型放電，而在體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NO的合成主要與谷氨酸的釋放有關(guān)，釋放的谷氨酸激活NR促使Ca2+內(nèi)流，胞漿內(nèi)Ca2+濃度達(dá)到400nM時，就會激活nNOS，促進(jìn)神經(jīng)元NO的生成，最終引起偏頭痛。 第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromoso-me ten，PTEN)是一個近年來新發(fā)現(xiàn)的同時具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不僅對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持具有重要作用，同時與腦缺血、癲癇、藥物成癮性等神經(jīng)精神障礙疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)PI'EN可對谷氨酸通過NMDAR誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用,但PTEN基因是否可通過調(diào)節(jié)NR2B磷酸化影響慢性偏頭痛的病理過程，目前尚未見相關(guān)報道。 本研究在已知NR2B-Tyr／NOS／NO通路很有可能是慢性偏頭痛發(fā)病的病理機(jī)制之一與慢性偏頭痛的中樞致敏主要發(fā)生在三叉神經(jīng)脊束核的基礎(chǔ)上，利用RNAi重組腺病毒(AdR—siPTEN)下調(diào)偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核的PTEN基因，觀察其對慢性偏頭痛大鼠行為學(xué)的影響，同時探討PTEN是否可通過調(diào)節(jié)NR2B-Tyr影響NO的合成，繼而抑制慢性偏頭痛的維持。 材料與方法1動物分組及處理：以清潔級成年雄性Sprague—Dswley(SD)鼠為實驗對象，隨機(jī)分為4組。模型組：第一個月由硬腦膜注射炎性湯，每兩天一次，共14次，第二個月依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg，每周一次，共4次，制作實驗性慢性偏頭痛大鼠模型。對照組：與模型組同步對照，以生理鹽水代替炎性湯硬腦膜注射及硝酸甘油皮下注射。模型干預(yù)組：自模型組造模成功后，在三叉神經(jīng)脊束核處注射AdR-siPTEN以轉(zhuǎn)染模型組大鼠三叉神經(jīng)脊束核。對照干預(yù)組：與模型干預(yù)組同步，在三叉神經(jīng)脊束核處注射AdR-siPTEN以轉(zhuǎn)染對照組大鼠三叉神經(jīng)脊束核。 2行為學(xué)與痛閾觀察：第9周時觀察模型組、對照組、模型干預(yù)組、對照干預(yù)組60min-90min內(nèi)撓頭、咬尾、爬籠、往返運動的次數(shù)總和(每個癥狀出現(xiàn)1次計1分)。將Ectronic vorl Frey rigid tip探針安放于探針尖上，再刺激大鼠雙側(cè)眼眶周圍，逐漸施加壓力直到大鼠自動逃離，觀察此時的壓力值即為大鼠的機(jī)械性痛閾值。 3受試動物于轉(zhuǎn)染AdR-siPTEN后一周（第9周）分別斷頭處死，取大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織，液氮內(nèi)保存。 4取大鼠三叉神經(jīng)脊束核，作厚15μm連續(xù)冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察三叉神經(jīng)脊束核中熒光蛋白的表達(dá)。 5RT-PCR法半定量檢測大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織PTEN mRNA的表達(dá)。 6Western印跡法：對標(biāo)本進(jìn)行提取蛋白、蛋白定量后，煮沸，電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行蛋白印跡，顯色后照相并進(jìn)行灰度值分析。檢測大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達(dá)。 7NOS測定試劑盒、NO測定試劑盒測定各觀察組三叉神經(jīng)脊束核組織內(nèi)NOS、NO含量。 結(jié)果1大鼠行為學(xué)與痛閾結(jié)果：模型干預(yù)組較對照組與對照干預(yù)組行為學(xué)改變無明顯差異(P0.05)，模型組較對照組與對照干預(yù)組行為學(xué)改變有明顯差異(P0.05)，模型干預(yù)組較模型組行為學(xué)改變也有明顯差異(P0.05)。痛閾結(jié)果與行為學(xué)類似。 2大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒1周后，大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織出現(xiàn)紅色熒光蛋白陽性表達(dá)，表明PTEN基因腺病毒轉(zhuǎn)染成功。 3RT-PCR結(jié)果顯示PTEN mRNA的表達(dá)情況：與對照組相比，模型組PTEN mRNA表達(dá)無明顯差異(P0.05)。與對照干預(yù)組相比，模型干預(yù)組PTEN mRNA表達(dá)無明顯差異(P0.05)。對照干預(yù)組的PTENmRNA表達(dá)量為對照組的52.47%，具有顯著差異(P0.05)。模型干預(yù)組的PTEN mRNA表達(dá)量為模型組的53.22%，具有顯著差異(P0.05)。 4Western印跡法顯示PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達(dá)情況：PTEN蛋白在各組的表達(dá)與PTEN mRNA在各組的表達(dá)情況相似。與模型組相比，模型干預(yù)組NR2B-Tyr蛋白表達(dá)有明顯差異(P0.05)。與對照組相比，模型干預(yù)組NR2B-Tyr蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05)。對照組與對照干預(yù)組相比，NR2B-Tyr蛋白表達(dá)同樣有明顯差異(P0.05)。 5NOS、NO含量：與模型組相比，模型干預(yù)組NOS、NO表達(dá)有明顯差異(P0.05)。與對照組相比，模型干預(yù)組NOS、NO表達(dá)無明顯差異(P0.05)。對照組與對照干預(yù)組相比，NOS、NO表達(dá)也有明顯差異(P0.05)。 結(jié)論1慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核NOS、NO含量及NR2B-Tyr蛋白表達(dá)明顯增加。 2轉(zhuǎn)染AdR-siPTEN后，慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核PTEN mRNA及PTEN蛋白明顯降低，NR2B-Tyr蛋白表達(dá)明顯降低，NOS、NO含量明顯降低，表明下調(diào)PTEN基因?qū)β云^痛大鼠具有一定保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R747.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳力學(xué);姜利人;劉寶松;龍在云;康格非;;PTEN表達(dá)下調(diào)對神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)及其作用機(jī)制[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年19期

本文編號：1691000