PTEN介導(dǎo)NR2B-Tyr信號(hào)通路參與大鼠偏頭痛慢性化的維持機(jī)制
發(fā)布時(shí)間:2018-03-31 13:46
本文選題:慢性偏頭痛 切入點(diǎn):PTEN 出處:《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文
【摘要】:研究背景及目的偏頭痛是神經(jīng)內(nèi)科中最多見(jiàn)的可致殘疾病中的一種,可以嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,發(fā)作期處于感覺(jué)超敏狀態(tài),以自發(fā)痛(spontaneous pain)、痛覺(jué)過(guò)敏(hyperakesia)及觸誘發(fā)痛(allodynia)為特點(diǎn)。而慢性偏頭痛一般由發(fā)作性偏頭痛經(jīng)過(guò)數(shù)月到數(shù)年發(fā)展而成,其病理性進(jìn)展可以通過(guò)中樞致敏(central sensitization)來(lái)解釋?zhuān)娚韺W(xué)和影像學(xué)的研究表明,慢性偏頭痛的發(fā)生與腦干進(jìn)行性的異常變化有關(guān)。目前很多研究表明,慢性偏頭痛中樞高敏感性由NMDAR-NOS-NO介導(dǎo)。 N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體的一種類(lèi)型,屬于離子型受體,,其廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)神經(jīng)元信號(hào)的傳遞和基因表達(dá)的調(diào)控起著重要作用,還是突觸可塑性及皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)的主要調(diào)控者。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B共7種亞單位組成的異四聚體,其中NR1是功能亞單位,NR2和NR3是調(diào)節(jié)亞單。NR2亞單位包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D四種,其中NR2B受體亞型在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺(jué)敏化形成和慢性偏頭痛形成等方面均有重要作用。由于NMDAR通道活性由蛋白激酶和磷酸化介導(dǎo),所以慢性偏頭痛的維持很可能是由腦干三叉神經(jīng)尾核中NR2B的磷酸化來(lái)介導(dǎo)。 NO是在偏頭痛發(fā)作時(shí)起關(guān)鍵性作用的一種媒介分子,可以使三叉神經(jīng)系統(tǒng)各個(gè)水平的神經(jīng)元活化,包括腦干中的三叉神經(jīng)脊束核。NO體內(nèi)供體包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的結(jié)構(gòu)型NOS(eNOS,nNOS)以及不依賴(lài)Ca的誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS.iNOS)。在硬腦膜上滴入外源性NO供體硝酸甘油,可以引起大鼠三叉神經(jīng)脊束核的神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)型放電,而在體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,NO的合成主要與谷氨酸的釋放有關(guān),釋放的谷氨酸激活NR促使Ca2+內(nèi)流,胞漿內(nèi)Ca2+濃度達(dá)到400nM時(shí),就會(huì)激活nNOS,促進(jìn)神經(jīng)元NO的生成,最終引起偏頭痛。 第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromoso-me ten,PTEN)是一個(gè)近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的同時(shí)具有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)雙重磷酸酶活性的抑癌基因,其廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及正常功能的維持具有重要作用,同時(shí)與腦缺血、癲癇、藥物成癮性等神經(jīng)精神障礙疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)PI'EN可對(duì)谷氨酸通過(guò)NMDAR誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用,但PTEN基因是否可通過(guò)調(diào)節(jié)NR2B磷酸化影響慢性偏頭痛的病理過(guò)程,目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本研究在已知NR2B-Tyr/NOS/NO通路很有可能是慢性偏頭痛發(fā)病的病理機(jī)制之一與慢性偏頭痛的中樞致敏主要發(fā)生在三叉神經(jīng)脊束核的基礎(chǔ)上,利用RNAi重組腺病毒(AdR—siPTEN)下調(diào)偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核的PTEN基因,觀察其對(duì)慢性偏頭痛大鼠行為學(xué)的影響,同時(shí)探討PTEN是否可通過(guò)調(diào)節(jié)NR2B-Tyr影響NO的合成,繼而抑制慢性偏頭痛的維持。 材料與方法1動(dòng)物分組及處理:以清潔級(jí)成年雄性Sprague—Dswley(SD)鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為4組。模型組:第一個(gè)月由硬腦膜注射炎性湯,每?jī)商煲淮,?4次,第二個(gè)月依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg,每周一次,共4次,制作實(shí)驗(yàn)性慢性偏頭痛大鼠模型。對(duì)照組:與模型組同步對(duì)照,以生理鹽水代替炎性湯硬腦膜注射及硝酸甘油皮下注射。模型干預(yù)組:自模型組造模成功后,在三叉神經(jīng)脊束核處注射AdR-siPTEN以轉(zhuǎn)染模型組大鼠三叉神經(jīng)脊束核。對(duì)照干預(yù)組:與模型干預(yù)組同步,在三叉神經(jīng)脊束核處注射AdR-siPTEN以轉(zhuǎn)染對(duì)照組大鼠三叉神經(jīng)脊束核。 2行為學(xué)與痛閾觀察:第9周時(shí)觀察模型組、對(duì)照組、模型干預(yù)組、對(duì)照干預(yù)組60min-90min內(nèi)撓頭、咬尾、爬籠、往返運(yùn)動(dòng)的次數(shù)總和(每個(gè)癥狀出現(xiàn)1次計(jì)1分)。將Ectronic vorl Frey rigid tip探針安放于探針尖上,再刺激大鼠雙側(cè)眼眶周?chē),逐漸施加壓力直到大鼠自動(dòng)逃離,觀察此時(shí)的壓力值即為大鼠的機(jī)械性痛閾值。 3受試動(dòng)物于轉(zhuǎn)染AdR-siPTEN后一周(第9周)分別斷頭處死,取大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織,液氮內(nèi)保存。 4取大鼠三叉神經(jīng)脊束核,作厚15μm連續(xù)冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察三叉神經(jīng)脊束核中熒光蛋白的表達(dá)。 5RT-PCR法半定量檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織PTEN mRNA的表達(dá)。 6Western印跡法:對(duì)標(biāo)本進(jìn)行提取蛋白、蛋白定量后,煮沸,電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)膜,進(jìn)行蛋白印跡,顯色后照相并進(jìn)行灰度值分析。檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達(dá)。 7NOS測(cè)定試劑盒、NO測(cè)定試劑盒測(cè)定各觀察組三叉神經(jīng)脊束核組織內(nèi)NOS、NO含量。 結(jié)果1大鼠行為學(xué)與痛閾結(jié)果:模型干預(yù)組較對(duì)照組與對(duì)照干預(yù)組行為學(xué)改變無(wú)明顯差異(P0.05),模型組較對(duì)照組與對(duì)照干預(yù)組行為學(xué)改變有明顯差異(P0.05),模型干預(yù)組較模型組行為學(xué)改變也有明顯差異(P0.05)。痛閾結(jié)果與行為學(xué)類(lèi)似。 2大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒1周后,大鼠三叉神經(jīng)脊束核組織出現(xiàn)紅色熒光蛋白陽(yáng)性表達(dá),表明PTEN基因腺病毒轉(zhuǎn)染成功。 3RT-PCR結(jié)果顯示PTEN mRNA的表達(dá)情況:與對(duì)照組相比,模型組PTEN mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。與對(duì)照干預(yù)組相比,模型干預(yù)組PTEN mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。對(duì)照干預(yù)組的PTENmRNA表達(dá)量為對(duì)照組的52.47%,具有顯著差異(P0.05)。模型干預(yù)組的PTEN mRNA表達(dá)量為模型組的53.22%,具有顯著差異(P0.05)。 4Western印跡法顯示PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表達(dá)情況:PTEN蛋白在各組的表達(dá)與PTEN mRNA在各組的表達(dá)情況相似。與模型組相比,模型干預(yù)組NR2B-Tyr蛋白表達(dá)有明顯差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,模型干預(yù)組NR2B-Tyr蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。對(duì)照組與對(duì)照干預(yù)組相比,NR2B-Tyr蛋白表達(dá)同樣有明顯差異(P0.05)。 5NOS、NO含量:與模型組相比,模型干預(yù)組NOS、NO表達(dá)有明顯差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,模型干預(yù)組NOS、NO表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。對(duì)照組與對(duì)照干預(yù)組相比,NOS、NO表達(dá)也有明顯差異(P0.05)。 結(jié)論1慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核NOS、NO含量及NR2B-Tyr蛋白表達(dá)明顯增加。 2轉(zhuǎn)染AdR-siPTEN后,慢性偏頭痛大鼠模型三叉神經(jīng)脊束核PTEN mRNA及PTEN蛋白明顯降低,NR2B-Tyr蛋白表達(dá)明顯降低,NOS、NO含量明顯降低,表明下調(diào)PTEN基因?qū)β云^痛大鼠具有一定保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類(lèi)號(hào)】:R747.2
【參考文獻(xiàn)】
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1 陳力學(xué);姜利人;劉寶松;龍?jiān)谠?康格非;;PTEN表達(dá)下調(diào)對(duì)神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)及其作用機(jī)制[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年19期
本文編號(hào):1691000
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