發(fā)布時(shí)間：2018-03-29 03:12

  本文選題：多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞　切入點(diǎn)：6-羥基多巴胺　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景:帕金森病(Parkinson disease,PD)是常見(jiàn)的人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)細(xì)胞慢性進(jìn)行性變性死亡是PD最主要的病理特征,如何延緩和逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)細(xì)胞的變性死亡是當(dāng)前PD研究的重點(diǎn)之一。膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在DA能神經(jīng)細(xì)胞存活和損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)會(huì)應(yīng)激性啟動(dòng)自身修復(fù)性機(jī)制,激活細(xì)胞內(nèi)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和具有保護(hù)作用的基因表達(dá)。DA能神經(jīng)細(xì)胞具有表達(dá)和分泌GDNF的能力,DA能神經(jīng)細(xì)胞在損傷早期是否同樣具有應(yīng)激保護(hù)機(jī)制,GDNF是否參與了該種應(yīng)激性的自身修復(fù)?GDNF應(yīng)激性高表達(dá)的機(jī)制是什么?氧化應(yīng)激損傷是PD患者DA能神經(jīng)細(xì)胞變性死亡的重要原因,PD的經(jīng)典造模藥物6-OHDA對(duì)DA能神經(jīng)細(xì)胞的損傷主要是氧化應(yīng)激損傷。研究顯示,6-OHDA誘導(dǎo)的損傷早期的大鼠炓質(zhì)中磷酸化Akt1(phosphorylation of Akt1,p-Akt1)的表達(dá)上調(diào)。在腫瘤細(xì)胞中Akt1可以直接磷酸化眼發(fā)育缺失(eye absent,Eya)家族蛋白磷酸酶Eya1使其活化。轉(zhuǎn)錄輔助因子Eya1與轉(zhuǎn)錄因子正弦眼相關(guān)性同源盒2(sine oculis related homeobox2,Six2)共轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)Six2的轉(zhuǎn)錄活性。且在腎臟發(fā)育過(guò)程中,Six2能結(jié)合于GDNF啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)GDNF轉(zhuǎn)錄。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明損傷早期的DA能神經(jīng)細(xì)胞中Akt1、Eya1和Six2的磷酸化水平均發(fā)生改變。那么,在DA能神經(jīng)細(xì)胞早期損傷過(guò)程中,akt1、eya1及six2是否介導(dǎo)了gdnf的應(yīng)激性高表達(dá)?本研究擬通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),明確6-ohda誘導(dǎo)的da能神經(jīng)細(xì)胞損傷早期是否存在gdnf應(yīng)激性高表達(dá);gdnf應(yīng)激性高表達(dá)的機(jī)制是什么;以及應(yīng)激性高表達(dá)的gdnf可否保護(hù)損傷的da能神經(jīng)細(xì)胞。方法:為了觀察da能神經(jīng)細(xì)胞損傷早期是否存在gdnf的應(yīng)激性高表達(dá),首先,在紋狀體定位注射6-ohda構(gòu)建大鼠炓質(zhì)da能神經(jīng)細(xì)胞損傷早期模型,采用姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)能力;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtimepolymersechainreaction,qpcr)和免疫印跡(immunoblotting,ib)方法檢測(cè)gdnf表達(dá)。同時(shí),構(gòu)建離體da能神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,采用流式細(xì)胞術(shù)和ao/eb染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;qpcr和ib方法檢測(cè)gdnf表達(dá);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)gdnf的轉(zhuǎn)錄活性。為了探討損傷早期的da能神經(jīng)細(xì)胞中g(shù)dnf應(yīng)激性高表達(dá)的機(jī)制,首先,采用ib和免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)方法,離體觀察損傷不同時(shí)間點(diǎn)da能神經(jīng)細(xì)胞中p-akt1、p-eya1及p-six2的表達(dá)。同時(shí),構(gòu)建分別攜帶akt1、eya1、six2及攜帶敲減akt1干擾序列(akt1-shrna)、eya1-shrna及six2-shrna的質(zhì)粒,采用ib和ip方法觀察分別過(guò)表達(dá)/敲減上述基因時(shí),gdnf、p-eya1及p-six2的表達(dá);最后,染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)-qpcr方法,觀察six2能否結(jié)合于gdnf啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)gdnf轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步探討應(yīng)激性高表達(dá)的gdnf能否保護(hù)損傷的da能神經(jīng)細(xì)胞,使用gdnf抗體拮抗損傷早期的da能神經(jīng)細(xì)胞中應(yīng)激性性高表達(dá)的gdnf效應(yīng),采用ao/eb染色及臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)方法觀察da能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。結(jié)果:1.gdnf在6-ohda誘導(dǎo)的da能神經(jīng)細(xì)胞損傷早期應(yīng)激性高表達(dá)大鼠紋狀體部位定位注射6-ohda,處理1d組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著低于對(duì)照組,4d和7d組的運(yùn)動(dòng)能力高于1d和14d組;1d組炓質(zhì)中g(shù)dnf的mrna和蛋白的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,4d和7d組的表達(dá)量顯著高于1d和14d組;免疫熒光染色結(jié)果顯示gdnf表達(dá)于大鼠炓質(zhì)da能神經(jīng)細(xì)胞中。離體結(jié)果顯示6-ohda處理15min、30min和1h組的細(xì)胞凋亡率緩慢增高,6h和12h組凋亡率快速增高;處理15和30min組gdnf的mrna表達(dá)量顯著對(duì)照組,1h、3 h和6 h組的表達(dá)量高于15 min、30 min和12 h組;GDNF轉(zhuǎn)錄活性與mRNA的變化結(jié)果一致;GDNF的蛋白表達(dá)量在給藥3 h和6 h時(shí)也應(yīng)激性上調(diào)。2.Akt1/Eya1/Six2信號(hào)通路調(diào)控?fù)p傷早期DA能神經(jīng)細(xì)胞中GDNF的應(yīng)激性高表達(dá)培養(yǎng)的DA能神經(jīng)細(xì)胞給予6-OHDA作用不同時(shí)間時(shí),p-Akt1的表達(dá)量在損傷15min、30 min和1 h時(shí)應(yīng)激性上調(diào),p-Eya1的表達(dá)量在損傷30min、1 h和3 h時(shí)應(yīng)激性上調(diào)而p-Six2的表達(dá)量在給藥30 min和1 h時(shí)顯著降低。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Akt1并給予6-OHDA損傷1 h時(shí),GDNF及p-Eya1的表達(dá)量升高,p-Six2的表達(dá)量降低;敲減Akt1時(shí)的結(jié)果與此相反。過(guò)表達(dá)Eya1并給予6-OHDA損傷1 h時(shí),GDNF的表達(dá)量升高,p-Six2的表達(dá)量降低;敲減Eya1時(shí)的結(jié)果與此相反。過(guò)表達(dá)Six2并給予6-OHDA損傷1 h時(shí),GDNF的表達(dá)量升高,敲減Six2時(shí)表達(dá)量降低;此外,ChIP-qPCR結(jié)果顯示,損傷早期的DA能神經(jīng)細(xì)胞中,Six2通過(guò)直接結(jié)合于GDNF啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)GDNF的轉(zhuǎn)錄。3.應(yīng)激性高表達(dá)的GDNF對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的DA能神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用培養(yǎng)的DA能神經(jīng)細(xì)胞給予6-OHDA作用2 h時(shí),加入GDNF抗體阻斷應(yīng)激性表達(dá)的GDNF效應(yīng),結(jié)果顯示DA能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著增高。此外,培養(yǎng)的DA能神經(jīng)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Six2,然后給予6-OHDA作用12 h時(shí),過(guò)表達(dá)Six2組的GDNF蛋白的表達(dá)量升高,DA能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率降低;同時(shí),大鼠黑質(zhì)部定位注射攜帶Six2的慢病毒顆粒,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Six2組的PD大鼠炓質(zhì)中GDNF的表達(dá)量明顯增高,且該組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力得到了改善。結(jié)論:6-OHDA誘導(dǎo)損傷早期的DA能神經(jīng)細(xì)胞可通過(guò)Akt1/Eya1/Six2信號(hào)通路促進(jìn)GDNF的應(yīng)激性高表達(dá),從而保護(hù)損傷早期的DA能神經(jīng)細(xì)胞。本研究可為尋求PD病人早期治療的新靶點(diǎn)從而逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)細(xì)胞的變性死亡提供理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李靜;王麗娜;肖紅玲;李霞;楊繼軍;;電針對(duì)帕金森病大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的影響[J];針刺研究;2014年03期

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本文編號(hào)：1679288