本文選題：外泌體　切入點(diǎn)：缺血再灌注損傷　出處：《南昌大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的在腦缺血的治療中,遠(yuǎn)程缺血后處理(Remote ischemia postconditioning,RIP)能減少缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷,然而,其機(jī)制未明。在本研究中,我們推測(cè)RIP對(duì)腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用是由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體所介導(dǎo)的,探討外泌體對(duì)人SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞I/R損傷后的影響。方法1.第一步建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型、遠(yuǎn)程缺血后處理模型,采用TTC染色、HE染色、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠大腦組織,評(píng)估損傷程度。2.第二步建立人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)缺氧再灌注損傷模型(HUVEC I/R)及人SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞缺氧再灌注模型(SH-SY5Y I/R),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,確定缺氧再灌注(I/R)時(shí)間;分別提取動(dòng)物血清及HUVECs培養(yǎng)上清液中的外泌體(Exosome),電鏡鑒定外泌體形態(tài),粒徑分析外泌體數(shù)量;采用免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠腦海馬組織中外泌體標(biāo)記蛋白CD63,HSP70,TSG101的表達(dá)量變化;Western blot與流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清中Exosome特異性蛋白CD63、HSP70和TSG101。3.第三步研究HUVEC來(lái)源外泌體對(duì)I/R損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移及侵襲能力的影響,同時(shí),檢測(cè)凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果1、成功建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型、遠(yuǎn)程缺血后處理模型;并檢測(cè)再灌注24h后大鼠大腦梗死程度:a.TTC染色結(jié)果提示缺血后處理(RIP)組大鼠大腦缺血梗死體積明顯較手術(shù)(Model)組減少,假手術(shù)組(Sham)無(wú)梗死;b.HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大腦海馬解剖結(jié)構(gòu)完整,飽滿,無(wú)明顯凋亡;RIP組細(xì)胞萎縮,出現(xiàn)凋亡;Model組細(xì)胞萎縮及凋亡程度均較RIP組組明顯加重;c.免疫組化染色結(jié)果提示RIP組和Model組大鼠大腦海馬組織凋亡率較Sham組顯著增高,且RIP組凋亡率低于Model組。2、成功建立HUVEC I/R損傷模型及SH-SY5Y I/R損傷模型,確定I/R時(shí)間為6h/24h;采用超速離心法成功提取血清及HUVECs培養(yǎng)上清液Exosome:a.免疫組化染色結(jié)果表明,Sham,Model,RIP各組大鼠腦海馬組織中外泌體標(biāo)記蛋白CD63,HSP70,TSG101的表達(dá)量無(wú)明顯變化;b.透射電鏡及粒徑分析結(jié)果提示,外泌體形態(tài)呈圓形或橢圓形,直徑在40-100nm之間,RIP組外泌體數(shù)量較Model組顯著增高;c.Western Blot結(jié)果顯示,各組血清中CD63,HSP70,TSG101蛋白均有表達(dá),但RIP組較Sham,Model組表達(dá)量顯著上升;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,各組血清外泌體均表達(dá)CD63,HSP70,TSG101蛋白,且RIP組表達(dá)量較其余兩組顯著增高。3、CCK8實(shí)驗(yàn)及Edu實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HUVECs來(lái)源外泌體能有效減輕I/R損傷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力和增殖能力的影響。4、HUVECs來(lái)源外泌體對(duì)I/R損傷后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響:a.免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、Hochest 33258實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明I/R損傷后細(xì)胞凋亡顯著增加,加入Exosome后能夠有效減輕細(xì)胞凋亡;b.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果提示:I/R損傷后周期阻滯在G0/G1期的SH-SY5Y細(xì)胞顯著增多,S期細(xì)胞比例顯著降低;與SH-SY5Y I/R組比較.SH-SY5Y I/R+Exo組在G0/G1期的細(xì)胞比例降低,S期細(xì)胞比例增高。5、HUVECs來(lái)源外泌體能有效恢復(fù)I/R損傷后SH-SY5Y細(xì)胞侵襲和遷移能力。6、qPCR及Western blot結(jié)果提示I/R損傷后細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3的表達(dá)水平顯著增高,Bcl-2表達(dá)水平顯著降低;在Exosome處理后,I/R損傷后細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3的表達(dá)水平被下調(diào),Bcl-2表達(dá)水平被上調(diào)。結(jié)論1、RIP顯著減少大鼠大腦缺血海馬組織凋亡改變及缺血梗死體積。2、RIP增加大鼠血清外泌體數(shù)量及CD63,HSP70和TSG101的表達(dá)量。3、HUVECs來(lái)源外泌體能有效減輕I/R損傷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力和增殖能力的影響;HUVECs來(lái)源外泌體能有效恢復(fù)I/R損傷后SH-SY5Y細(xì)胞侵襲和遷移能力;并能夠促進(jìn)SH-SY5Y內(nèi)相關(guān)抗凋亡基因的表達(dá),提示外泌體有望成為治療腦卒中的有效治療手段之一。
[Abstract]:In the treatment of cerebral ischemia in remote ischemic postprocessing (Remote ischemia postconditioning, RIP) can reduce ischemia reperfusion injury (ischemia-reperfusion, I/R), however, its mechanism is not clear. In this study, we hypothesized that neuroprotective RIP on cerebral I/R injury with exosomes released by endothelial cells. Mediated, to explore the influence of exosomes on SH-SY5Y cells induced by I/R. Methods 1. first step to establish the rat right middle cerebral artery ischemia reperfusion model, processing model of remote ischemia by TTC staining, HE staining, staining of brain tissue of rats was detected by immunohistochemistry, evaluate the damage degree of.2. second the establishment of human umbilical vein endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) anoxia reperfusion injury model (HUVEC I/R) and SH-SY5Y cell hypoxia reperfusion model (SH-SY5Y I/R), flow cytometry Was used to detect cell apoptosis, hypoxia reperfusion time (I/R); were extracted from the serum and HUVECs culture supernatant of animal exosomes in electron microscopy (Exosome), identification of exosome exosome quantity morphology, particle size analysis; detected by immunohistochemical staining in hippocampus of rats brain and urinary marker CD63 protein, HSP70, expression of TSG101; Western and blot flow cytometry Exosome specific protein in the serum CD63, HSP70 and TSG101.3. third step HUVEC source of exosomes on SH-SY5Y cell proliferation, I/R injury and apoptosis, cell cycle, migration and invasion ability at the same time, the detection of apoptosis related molecular Caspase-3, the expression of Bax and Bcl-2. The results of the 1, successfully established the rat right middle cerebral artery ischemia reperfusion model, processing model and remote ischemia; detection of 24h after reperfusion in rats cerebral infarction: a.TTC staining Prompt ischemic postprocessing (RIP) rats cerebral ischemia infarct volume compared with surgery (Model) group, sham operation group (Sham) without infarction; b.HE staining results showed that the sham operation group of hippocampal anatomy complete, full, no obvious apoptosis; RIP cells atrophy, a group of cell atrophy and apoptosis; the degree of apoptosis was significantly higher than that of Model group RIP group increased; C. immunohistochemical staining showed that RIP group and Model group rat hippocampus apoptosis rate was significantly higher than that in Sham group, and the apoptosis rate of RIP group was lower than that of Model group.2, successfully established HUVEC I/R damage model and SH-SY5Y I/R damage model, determine the I/R time is 6h/24h; by ultracentrifugation successfully extracted the serum and HUVECs culture supernatant of Exosome:a. immunohistochemical staining showed that Sham, Model, HSP70 and RIP groups in hippocampus were foreign body urinary marker protein CD63, and the expression of TSG101 had no obvious change; B. transmission Electron microscopy and particle size analysis results suggest that exosome shapes were round or oval, with a diameter between 40-100nm, RIP group of exosome number was significantly higher than that in Model group; c.Western Blot showed that HSP70 CD63 in serum, the expression of TSG101 protein was RIP, but compared with group Sham, expression of Model group increased significantly; flow cytometry results showed that CD63 was expressed in the serum exosomes HSP70, TSG101 protein, and the expression of RIP group was significantly higher than that of other two groups.3, CCK8 and Edu experimental results indicate that HUVECs can effectively reduce the source of urinary I/R damage effects on SH-SY5Y cell viability and proliferation of.4, HUVECs source exosomes on SH-SY5Y cell apoptosis after I/R damage and cell cycle: A. immunofluorescence, flow cytometry, Hochest 33258 experimental results show that the apoptosis of I/R after injury significantly increased after adding Exosome can effectively reduce cell apoptosis; The B. flow cytometry showed that I/R after injury in G0/G1 phase arrest of SH-SY5Y cells increased significantly, the proportion of cells in S phase decreased significantly; and the SH-SY5Y I/R group.SH-SY5Y I/R+Exo group decreased the proportion of cells in G0/G1 phase, the cell ratio of S increased.5, HUVECs source can effectively restore I/R SH-SY5Y secretion after the injury of cell invasion and migration ability of.6, qPCR and Western blot showed that I/R damage Bax in cells, the expression level of Caspase-3 was significantly increased, the expression level of Bcl-2 was significantly decreased; after Exosome treatment, Bax cells within I/R after injury, the expression level of Caspase-3 was decreased, the expression level of Bcl-2 was increased. Conclusion 1. RIP was significantly reduced in rat cerebral ischemia hippocampus apoptosis and infarct size of.2, RIP increased serum exosome quantity and CD63 expression of.3 HSP70 and TSG101 HUVECs, source of excretion can effectively Reduce the I/R damage effects on SH-SY5Y cell growth and proliferation; HUVECs can effectively restore the I/R source of urinary SH-SY5Y cell invasion and migration ability after injury; and can promote the expression of SH-SY5Y in anti apoptosis gene, suggesting that exosomes in the treatment of stroke is expected to become the effective means of treatment.

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R743

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