發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 21:04

  本文選題：同型半胱氨酸　切入點(diǎn)：神經(jīng)元　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的通過(guò)建立SD大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO)模型,觀察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡的影響,通過(guò)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)和Hcy干預(yù)探討Hcy對(duì)缺血腦組織損傷的作用機(jī)制;通過(guò)體外培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs),觀察Hcy對(duì)NSCs增殖及損傷的影響,通過(guò)Hcy干預(yù)及基因表達(dá)譜芯片方法探討Hcy對(duì)NSCs增殖及損傷的作用機(jī)制。該課題旨在探討高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)對(duì)梗塞大腦的損傷機(jī)制,為腦梗塞疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。方法1.80只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,分別為假手術(shù)組(sham operation,SHAM組)、大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注模型組(MCAO組)、模型+同型半胱氨酸組(MCAO+Hcy組)和模型+同型半胱氨酸+3-甲基腺嘌呤組(MCAO+Hcy+3MA組),每組20只。Hcy干預(yù)按4 m L/kg標(biāo)準(zhǔn)隔天尾靜脈注射0.8 mg/m L Hcy溶液,每周稱量一次體重,根據(jù)體重調(diào)整干預(yù)劑量。預(yù)干預(yù)21 d后建立MCAO模型。造模前5 d MCAO+Hcy+3MA組每天尾靜脈注射3MA(5 mmol/L,4 m L/kg·d)。MCAO手術(shù)后72 h HE染色觀察腦組織病理改變,TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,采用酶循環(huán)法檢測(cè)大鼠血漿中Hcy濃度,透射電鏡觀察腦組織細(xì)胞損傷及自噬情況,免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)不同組別大鼠腦組織中的自噬標(biāo)記蛋白LC3B和Beclin-1的表達(dá)情況,免疫熒光標(biāo)記法(immunofluorescence,IF)檢測(cè)腦組織細(xì)胞中LC3B和Beclin-1的表達(dá)及分布情況。2.取24 h內(nèi)新生SD大鼠大腦分離神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分成2組:正常對(duì)照組(Control組)、Hcy組(培養(yǎng)液中添加Hcy 150μmol/L)。免疫印跡法檢測(cè)NSCs自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、m TOR、p70S6K表達(dá)情況,電鏡觀察NSCs損傷及自噬情況,Agilent Sure Print G3 Rat GE(8*60K,Design ID:028279)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)NSCs基因表達(dá)譜變化,免疫印跡法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。結(jié)果1.酶循環(huán)法檢測(cè)大鼠血漿發(fā)現(xiàn)Hcy干預(yù)組大鼠血漿Hcy濃度顯著升高。HE染色發(fā)現(xiàn)SHAM組腦組織細(xì)胞形態(tài)正常,MCAO后細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷,與MCAO組比,MCAO+Hcy組細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重,MCAO+Hcy+3MA組大鼠腦組織細(xì)胞損傷程度比MCAO+Hcy組輕。TUNEL染色結(jié)果顯示MCAO組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較SHAM組高(P0.05),而MCAO+HCY組細(xì)胞凋亡程度比MCAO組更嚴(yán)重(P0.05)。與MCAO+HCY組相比,MCAO+HCY+3MA組凋亡率顯著下降(P0.05)。電鏡下觀察腦組織切片發(fā)現(xiàn)MCAO組細(xì)胞出現(xiàn)顯著損傷,有少量自噬小體產(chǎn)生,與MCAO組相比,MCAO+Hcy組腦組織細(xì)胞損傷程度更嚴(yán)重,鏡下可見更多的自噬小體。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與SHAM組相比,MCAO組LC3B、Beclin-1表達(dá)上調(diào),MCAO+HCY組LC3B、Beclin-1表達(dá)較MCAO組進(jìn)一步上調(diào),而與MCAO+HCY組相比,MCAO+Hcy+3MA組LC3B、Beclin-1表達(dá)下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示:LC3B(或Beclin-1)主要在皮質(zhì)缺血半暗帶的神經(jīng)元胞漿中表達(dá),不在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。MCAO組8-OHd G陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于SHAM組(P0.05)。與MCAO組比較,MCAO+Hcy組8-OHd G陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(P0.05)。MCAO+Hcy+3MA組8-OHd G陽(yáng)性細(xì)胞少于MCAO+Hcy組(P0.05)。2.本實(shí)驗(yàn)成功地從新生SD大鼠大腦中分離NSCs進(jìn)行培養(yǎng)并用Hcy干預(yù),Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):Hcy干預(yù)后NSCs LC3-II與LC3-I比值升高、Beclin-1表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。電鏡觀察結(jié)果表明:Hcy干預(yù)后細(xì)胞損傷嚴(yán)重,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了很多自噬小體和自噬溶酶體。采用基因表達(dá)譜芯片對(duì)細(xì)胞m RNA的表達(dá)情況進(jìn)行研究,篩選出干預(yù)后發(fā)生變異的基因457種并進(jìn)行GO、pathway等相關(guān)分析,結(jié)果表明Hcy廣泛影響了細(xì)胞內(nèi)的多種生理、病理活動(dòng),特別是突觸囊泡循環(huán)、萜類化合物的生物合成、Rap1信號(hào)通路、抗生素的生物合成、丁酸代謝、甲狀腺癌、上皮細(xì)胞細(xì)菌侵入、縫隙連接等通路,其中包括m TOR通路。WB結(jié)果也驗(yàn)證了Hcy對(duì)m TOR通路蛋白m TOR、p70S6K的影響。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注(MCAO)模型,發(fā)現(xiàn)Hcy加劇了缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的損傷,激活了自噬,而抑制自噬能顯著改善Hcy導(dǎo)致的自噬損傷。本研究提示Hcy可能通過(guò)激活自噬導(dǎo)致了腦組織的損傷。我們還發(fā)現(xiàn)Hcy導(dǎo)致的LC3B和Beclin-1的表達(dá)增加主要發(fā)生于皮層的神經(jīng)元,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中幾乎沒(méi)有表達(dá)。說(shuō)明Hcy可能通過(guò)神經(jīng)元內(nèi)自噬的激活造成腦組織的損傷。此外,Hcy干預(yù)后8-OHd G水平上調(diào),故Hcy導(dǎo)致了腦缺血后皮質(zhì)神經(jīng)元自噬的過(guò)度激活,而氧化應(yīng)激可能是其中的一個(gè)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)成功分離新生SD大鼠NSCs進(jìn)行培養(yǎng)。Hcy干預(yù)結(jié)果顯示:Hcy增加了NSCs的損傷和細(xì)胞內(nèi)自噬水平,自噬小體增加,LC3-II/LC3-I的比值升高,Beclin-1蛋白表達(dá)增加。說(shuō)明Hcy干預(yù)可能通過(guò)激活自噬造成NSCs損傷。NSCs基因芯片及WB結(jié)果顯示Hcy干預(yù)影響了m TOR通路。提示Hcy干預(yù)可能通過(guò)m TOR通路激活自噬造成NSCs損傷。綜上兩部分結(jié)果,我們得出結(jié)論——Hcy可以通過(guò)m TOR通路激活NSCs自噬,通過(guò)ROS途徑激活腦組織神經(jīng)元的自噬,造成神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

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1 Yi-hao Deng;Hong-yun He;Li-qiang Yang;Peng-yue Zhang;;Dynamic changes in neuronal autophagy and apoptosis in the ischemic penumbra following permanent ischemic stroke[J];Neural Regeneration Research;2016年07期

2 王競(jìng);杜俊蓉;;缺血性腦損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2008年04期

3 張福林,端禮榮;同型半胱氨酸對(duì)胚胎海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2003年07期

4 郭玉璞;缺血性腦損傷的病理生理基礎(chǔ)和腦梗塞的治療原則[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1998年02期

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本文編號(hào)：1664854