發(fā)布時(shí)間：2018-03-22 05:19

  本文選題：膠質(zhì)瘤細(xì)胞　切入點(diǎn)：RIP1　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:惡性膠質(zhì)瘤是最常見的腦部原發(fā)性惡性腫瘤,即使患者接受手術(shù)治療并且輔以術(shù)后放療和化療,平均生存期也不過一年多[4]。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)目前使用的化療和放療不敏感,不易發(fā)生凋亡,因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性壞死或可成為一種新型而有效的治療策略[6,7]。不同于細(xì)胞凋亡,程序性壞死作為一種caspase非依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式,具有與壞死相似的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,并且主要受到受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)和3(RIP3)調(diào)控。當(dāng)誘導(dǎo)程序性壞死時(shí),被激活的RIP1通過RIP同型作用基團(tuán)與其下游信號(hào)因子RIP3相互作用形成一種稱為“壞死體”(necrosome)的蛋白復(fù)合體,其中RIP3可能通過RIP1或自磷酸化作用而被激活[8]。細(xì)胞程序性壞死通常伴有細(xì)胞能量耗竭、細(xì)胞膜破裂以及細(xì)胞核DNA雙鏈斷裂,研究發(fā)現(xiàn),RIP1和RIP3的激活能夠?qū)е录?xì)胞能量耗竭和細(xì)胞膜破裂[9,10],而其在細(xì)胞核DNA雙鏈斷裂中發(fā)揮的作用尚不明確[11]。DNA雙鏈斷裂通常發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)或者受到電離輻射、化療藥物、氧化應(yīng)激作用之后[12]。通常,DNA雙鏈斷裂后如果得不到修復(fù)或者被錯(cuò)誤修復(fù),細(xì)胞將無法繼續(xù)存活,因此DNA雙鏈斷裂對(duì)于細(xì)胞來講是最嚴(yán)重的DNA損傷[13]。最近研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞染色質(zhì)裂解與DNA雙鏈斷裂密切相關(guān)[11]。當(dāng)DNA雙鏈斷裂時(shí),毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白(ATM)或DNA依懶性蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)將被激活,進(jìn)而在絲氨酸139位點(diǎn)將組氨酸突變亞型H2AX磷酸化產(chǎn)生γH2AX[14]。無論是體內(nèi)還是體外,γH2AX都能特異性地聚集在DNA雙鏈斷裂的位點(diǎn),因此被認(rèn)為是DNA雙鏈斷裂的敏感性分子標(biāo)志物[15,16]。在細(xì)胞程序性壞死過程中,盡管γH2AX能夠作為DNA修復(fù)時(shí)各種蛋白分子發(fā)揮作用的平臺(tái),但是它同樣能夠促使AIF(凋亡誘導(dǎo)因子)從線粒體向核內(nèi)轉(zhuǎn)移而形成DNA降解復(fù)合體[11]。因此,DNA雙鏈斷裂是程序性壞死過程中導(dǎo)致染色質(zhì)裂解的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。紫草素是從紫草中提取出的天然的萘醌類化合物。近年來研究表明,紫草素可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[17],除此之外,在其他癌細(xì)胞諸如乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤及骨肉瘤同樣可以產(chǎn)生類似的作用[18-20]。另外,紫草素可以造成DNA損傷且能抑制DNA合成[21,22]。然而,紫草素誘導(dǎo)DNA損傷是否受到RIP1和RIP3調(diào)控,尚不明確。因此,我們使用大鼠及人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及移植瘤鼠模型來研究RIP1和RIP3在紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂中的作用及機(jī)制。目的:用大鼠及人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及移植瘤鼠模型來研究RIP1和RIP3在紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂中的作用及機(jī)制。方法:1、通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率2、通過流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法(Annexin V-FITC和PI雙染)研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡模式。3、通過單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳法(彗星實(shí)驗(yàn))檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA損傷和DNA雙鏈斷裂。4、通過DCFH-DA探針檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的活性氧(ROS)生成水平的改變,并通過Mito SOX red探針檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體超氧化物生成水平的改變。5、通過DTNB-GSSH還原酶回收檢測(cè)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GSH含量的改變。6、通過si RNA沉默RIP1和RIP3基因來研究RIP1和RIP3在紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞程序性壞死中的作用。7、通過建立裸鼠C6細(xì)胞移植瘤模型研究紫草素在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。8、通過免疫蛋白印跡法(western-blotting)檢測(cè)分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞及裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤組織中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平變化。9、通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其培養(yǎng)液中TNF-α水平改變。10、通過免疫組織化學(xué)染色法觀察膠質(zhì)瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤的改變。11、通過免疫熒光染色法在激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞中γH2AX表達(dá)的改變。12、通過免疫共沉淀法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤組織中RIP1和RIP3的相互作用。結(jié)果:1、MTT法檢測(cè)結(jié)果表明:在一定濃度范圍內(nèi),紫草素作用3小時(shí)后能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存率,而不影響正常細(xì)胞的生存率。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明:紫草素誘發(fā)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生壞死而非凋亡。2、在紫草素作用下,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RIP1和RIP3表達(dá)水平增加,并呈現(xiàn)時(shí)間梯度依賴性。免疫共沉淀RIP1或RIP3結(jié)果提示:紫草素能夠促進(jìn)RIP1與RIP3結(jié)合形成壞死體。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明:RIP1抑制劑(NEC-1)或RIP3抑制劑(GSK872)以及si RNA沉默RIP1或RIP3基因能夠降低紫草素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。而NEC-1能夠抑制紫草素所致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RIP1過度表達(dá)。GSK872能夠抑制紫草素所致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RIP3過度表達(dá)。紫草素作用時(shí)間延長,CYPD表達(dá)逐漸增加而caspase8表達(dá)逐漸降低,而caspase3,被激活的caspase3以及被激活的caspase8表達(dá)水平無明顯變化。紫草素能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放TNF-α。3、單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳法(彗星實(shí)驗(yàn))結(jié)果表明,紫草素能夠?qū)е履z質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷和DNA雙鏈斷裂,而這種效應(yīng)可被NEC-1或GSK872抑制。免疫熒光染色結(jié)果表明,紫草素能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中γH2AX的形成。紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞γH2AX和p-ATM表達(dá),并呈時(shí)間梯度依賴性,而NEC-1或GSK872,si RNA沉默RIP1或RIP3基因能抑制γH2AX和p-ATM過度表達(dá)。4、裸鼠C6細(xì)胞移植瘤模型結(jié)果表明,相對(duì)于對(duì)照組,紫草素處理組的移植瘤體積和重量明顯減小,且移植瘤組織中RIP1、RIP3、γH2AX和p-ATM過度表達(dá),RIP1和RIP3組合成壞死體亦增加。另外,紫草素處理組的移植瘤組織中HMGB1,HSP70及鈣網(wǎng)蛋白水平升高,而免疫組織化學(xué)染色法觀察到移植瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤明顯增加。5、DCFH-DA探針檢測(cè)法可觀察到紫草素能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度生成,而NEC-1或GSK872能抑制ROS過度生成。Mito SOX red探針檢測(cè)法觀察到紫草素能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體超氧化物過度生成,而NEC-1或GSK872能抑制超氧化物過度生成。DTNB-GSSH還原酶回收檢測(cè)法結(jié)果表明,紫草素使膠質(zhì)瘤細(xì)胞GSH的生成減少,而NEC-1或GSK872預(yù)處理后,紫草素誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞GSH生成減少效應(yīng)明顯受到抑制。6、DCFH-DA探針熒光檢測(cè)結(jié)果提示過氧化氫能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度生成,NAC可阻斷ROS過度生成。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明,過氧化氫使膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率下降,而NAC能阻斷過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞生存率下降。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過氧化氫能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA損傷和DNA雙鏈斷裂。過氧化氫能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中γH2AX和p-ATM過度表達(dá),而NAC可抑制γH2AX和p-ATM過度表達(dá)。另外,NAC可阻斷紫草素誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞ROS過度生成,生存率下降,DNA損傷和DNA雙鏈斷裂,RIP1,RIP3,γH2AX和p-ATM過度表達(dá)。此外,NAC和NEC-1均可抑制RIP1和RIP3相互作用組合成壞死體。結(jié)論:1、紫草素對(duì)體內(nèi)和體外的膠質(zhì)瘤細(xì)胞均具有顯著的殺傷作用。2、紫草素提高了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RIP1、RIP3的表達(dá)、促進(jìn)RIP1和RIP3之間的相互作用。因此,紫草素誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Necroptosis.3、紫草素在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Necroptosis的過程中伴有DNA雙鏈斷裂;ROS是紫草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的效應(yīng)分子。4、RIP1和RIP3通過促進(jìn)線粒體內(nèi)過氧化物的生成以及降低細(xì)胞內(nèi)GSH的水平,從而誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的過度生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1647238