本文選題：阿曼托雙黃酮　切入點(diǎn)：癲癇　出處：《寧夏醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：癲癇是常見的腦部疾病,以慢性反復(fù)自發(fā)性發(fā)作為特征,并常伴有情感和認(rèn)知功能障礙。目前癲癇的治療仍以藥物治療為主,經(jīng)合理規(guī)范的抗癇藥物治療,有約20%~30%的患者發(fā)作仍得不到有效緩解,這類癲癇被稱為難治性癲癇。顳葉癲癇是成人最常見的難治性癲癇,常繼發(fā)于各種原始的腦損傷并誘導(dǎo)腦內(nèi)級聯(lián)事件發(fā)生,最終導(dǎo)致癲癇易感性增高并產(chǎn)生反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作,這一過程稱為癲癇發(fā)生(epileptogenesis)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展癲癇發(fā)生的概念得到不斷更新,越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí),腦內(nèi)炎癥過程是癲癇發(fā)生的一個(gè)具有決定性的病理機(jī)制,它貫穿于癲癇發(fā)生的各個(gè)階段,是其各種病理生理變化的一個(gè)共同背景,而最新的共識將癲癇發(fā)生定義為能夠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作癥狀后并且伴隨腦組織生長發(fā)育的一種炎癥反應(yīng)過程。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明癲癇發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,特別是在腦部癲癇易發(fā)區(qū)域,相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)和功能都會出現(xiàn)病理生理學(xué)上的持續(xù)變化,導(dǎo)致腦內(nèi)新的病理環(huán)境的產(chǎn)生,最終誘發(fā)癲癇。雖然目前對于癲癇發(fā)生的預(yù)防和治療仍存在較大爭議,并且效果有待商榷,但是癲癇發(fā)生與炎癥反應(yīng)的關(guān)系及機(jī)制仍然是臨床與基礎(chǔ)研究關(guān)注的熱點(diǎn)。阿曼托雙黃酮(amentoflavone,AF)是具有多種生物活性的天然多酚類化合物,其在抗炎、抗微生物、抗氧化、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等方面可以發(fā)揮重要作用。研究證實(shí),AF能夠通過抑制眾多炎性因子而發(fā)揮抗炎作用。其在腫瘤細(xì)胞中通過抑制核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)的活化來抑制腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)和前列腺素(Prostaglandins,PG)E2的表達(dá),降低由NF-κB介導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)生成一氧化氮(nitric oxide,NO)的能力;在潰瘍性結(jié)腸炎模型中,AF預(yù)處理能夠減輕結(jié)腸黏膜損傷,抑制脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,顯著降低NO、TNF-α、白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、i NOS以及COX-2的水平。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中AF通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-1β和IL-6的表達(dá)來促進(jìn)抗炎反應(yīng);AF能夠顯著下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)水平,抑制重要炎癥介質(zhì)PGE2的合成;此外,AF能夠通過干擾半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specificprotease,Caspase)活化來阻斷細(xì)胞凋亡。因此,我們推測AF能夠通過抑制調(diào)控癲癇發(fā)生時(shí)腦內(nèi)炎癥通路中的相關(guān)因子,降低神經(jīng)元損傷預(yù)防癲癇的發(fā)生。本研究以氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型為基礎(chǔ),應(yīng)用電生理、行為學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)等手段,驗(yàn)證如下假設(shè):AF能夠通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活、下調(diào)炎癥通路中相關(guān)因子水平來調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,預(yù)防癲癇的發(fā)生。第一部分阿曼托雙黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠癲癇易感性和認(rèn)知功能的影響目的:明確AF預(yù)處理對氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇模型癲癇易感性和認(rèn)知功能的影響。方法:100只SD大鼠隨機(jī)分為5組:AF預(yù)處理組(pre-AF組)、AF治療組(AF組)、丙戊酸鈉預(yù)處理組(pre-VPA組)、癲癇組(EP組)、空白對照組(Control組)。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型,采用Racine評分評估癲癇模型的發(fā)作等級差異,腦電信號監(jiān)測各組大鼠電生理變化,Morris水迷宮和Intelli Cage智能行為學(xué)檢測分析系統(tǒng)評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,客觀評價(jià)AF預(yù)處理對致癇大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE)和自發(fā)性發(fā)作易感性的影響,明確AF對致癇大鼠癲癇發(fā)生的預(yù)防作用。結(jié)果:pre-AF組在造模后少有癲癇發(fā)作,且發(fā)作等級明顯降低,發(fā)作時(shí)間縮短,腦電信號顯示癲癇樣波出現(xiàn)的頻率及波幅均明顯降低,行為學(xué)和腦電信號表現(xiàn)與Control組相比無明顯差異。Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中pre-AF組大鼠逃避潛伏期較AF組、pre-VPA組和EP組縮短(P0.05);在空間探索試驗(yàn)中,pre-AF組大鼠穿臺次數(shù)比AF組、pre-VPA組和EP組顯著增多(P0.05)。Intelli Cage行為學(xué)檢測顯示,鼻觸學(xué)習(xí)測試中,與control組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問(visit)次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與EP組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確訪問次數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯;同時(shí),對鼻戳(nosepoke)正確次數(shù)的觀察中得到了結(jié)果與visit一致;在位置學(xué)習(xí)測試中,與control組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確訪問次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與EP組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確訪問次數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中pre-AF組增加次數(shù)最明顯;位置逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)測試與位置學(xué)習(xí)測試結(jié)果相一致;在強(qiáng)化學(xué)習(xí)測試中,與control組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組、EP組的正確鼻戳次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與EP組相比,pre-AF組、AF組、pre-VPA組的正確鼻戳次數(shù)有明顯改善(P0.05),其中pre-AF組改善最明顯;強(qiáng)化逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)測試與強(qiáng)化學(xué)習(xí)測試結(jié)果相一致。結(jié)論:AF的預(yù)防性用藥可以降低癲癇大鼠發(fā)作級別、縮短發(fā)作時(shí)間、改善空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降,降低癲癇易感性。第二部分阿曼托雙黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響目的:研究AF對氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)情況,明確其在預(yù)防癲癇發(fā)生過程中的作用及可能的機(jī)制。方法:雄性SD大鼠100只,分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型,應(yīng)用Nissel染色及TUNEL染色觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷和凋亡情況,免疫組化和Western-Blot技術(shù)檢測大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的分布和表達(dá)水平;同時(shí)檢測各組大鼠海馬中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、GSH水平以及過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性。結(jié)果:SE后72h,和control組相比,pre-AF組Nissel染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目無明顯差異(P0.05)而較EP組明顯增多(P0.05);與control組相比,pre-AF組TUNEL染色顯示大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)目均無明顯差異(P0.05),較EP組明顯減少(P㩳0.05);免疫組化顯示,與control組相比,pre-AF組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)目均無明顯差異(P0.05),較EP組明顯減少(P㩳0.05);Western Blot顯示,pre-AF組與control組caspase-3蛋白表達(dá)量無顯著差異(P0.05),而較其他各組均顯著降低(P0.01)。對各組大鼠海馬氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測顯示,與control組相比,SE后24h和36h pre-AF組的GSH水平及SOD活力均無明顯差異(P0.05),較EP組明顯升高(P㩳0.05);而pre-AF組CAT、MDA和NO水平與control組相比無明顯差異(P0.05),較EP組明顯降低(P㩳0.05)。結(jié)論:AF預(yù)處理通過抑制海馬氧化應(yīng)激水平降低癲癇誘發(fā)的神經(jīng)元損傷和凋亡,預(yù)防癲癇發(fā)生。第三部分阿曼托雙黃酮對氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和海馬炎癥反應(yīng)的影響目的:研究AF對氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,進(jìn)一步探討其預(yù)防癲癇發(fā)生的機(jī)制及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)生過程中可能的作用。方法:雄性SD大鼠100只,分組同第一部分。建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型,應(yīng)用免疫組化觀察大鼠海馬中Iba-1、GFAP的分布和表達(dá),于SE后24h、48h、72h、96h提取大鼠海馬組織,應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測炎癥通路中的關(guān)鍵因子NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)變化,ELISA法檢測下游炎性因子IL-1β、TNF-α、PGE2水平。結(jié)果:免疫組化顯示,AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見較多Iba-1陽性細(xì)胞,與control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而pre-AF組Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)量增加明顯減少,與control組相比無明顯差異(P0.05);AF組、pre-VPA組及EP組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)可見較多GFAP陽性細(xì)胞,與control組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而pre-AF組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加明顯減少,與control組相比無明顯差異(P0.05);Western Blot顯示,SE后24h、48h、72h、96h,與control組相比各組大鼠海馬COX-2和NF-κB p65蛋白水平均有不同程度升高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而與EP組相比,pre-AF組蛋白水平均顯著降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);除control組以外,各組COX-2和NF-κB p65蛋白表達(dá)在時(shí)間順序上呈先高后低的變化趨勢。SE后24h、48h、72h、96h,各組大鼠海馬炎癥因子IL-1β、PGE2和TNF-α水平均有不同程度升高,與control組相比其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而與EP組相比,pre-AF組各炎癥因子水平均顯著降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:AF能夠通過抑制匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬COX-2和NF-κB p65的表達(dá),降低IL-1β、TNF-α、PGE2水平,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生發(fā)揮預(yù)防癲癇發(fā)和神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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