本文選題：3%氯化鈉　切入點(diǎn)：高滲鹽水　出處：《中南大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 腦水腫是臨床常見(jiàn)危急重癥。由腦水腫所引起的顱內(nèi)高壓可引起腦血流的減少和繼發(fā)性缺血性腦損傷的發(fā)生,也可引起腦疝的形成而危及生命。高滲鈉溶液在臨床上已廣泛應(yīng)用于腦外傷、腦出血、腦梗塞所致腦水腫等的治療。目前常用的高滲鈉濃度有3%、5%、7.5%、10%、23.4%,大量臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了其療效.近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道,證實(shí)高滲鈉溶液治療腦水腫的療效優(yōu)于甘露醇,而且其副作用少。 高滲鈉治療腦水腫具體的機(jī)制尚不完全清楚,其可能的機(jī)制有(1)滲透性作用；(2)增加局部腦組織灌注；(3)減輕腦損傷后的炎癥反應(yīng)；(4)恢復(fù)細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性等。Zeng HK在大鼠缺血性腦損傷模型上發(fā)現(xiàn)10%氯化鈉可下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)的表達(dá)。本研究組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3%氯化鈉可下調(diào)兔大腸桿菌腦膜炎腦組織AQP4的表達(dá)。這提示3%氯化鈉可能通過(guò)下調(diào)AQP4的表達(dá)減輕腦水腫。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是大腸桿菌細(xì)胞壁上的主要成分,也是其主要的致病成分,與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步觀察3%氯化鈉對(duì)脂多糖所致腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達(dá)的影響,探討3%氯化鈉治療腦水腫的非滲透機(jī)制。 目的 (1)觀察3%氯化鈉對(duì)脂多糖小鼠腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達(dá)的影響,探討3%氯化鈉治療脂多糖小鼠腦水腫的非滲透機(jī)制。 (2)在細(xì)胞水平探討蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)在3%氯化鈉下調(diào)AQP4表達(dá)中的作用。1建立小鼠脂多糖腦水腫模型 1.1方法 (1)觀察脂多糖對(duì)腦組織含水量變化的時(shí)效和量效作用：昆明小白鼠隨機(jī)分為2大組：對(duì)照組(control組)和脂多糖組(LPS組),各組小鼠數(shù)見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10、20、40mg/kg),對(duì)照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,分別于脂多糖注射6、12小時(shí)后將小鼠處死,迅速取出大腦進(jìn)行含水量測(cè)定。 (2)觀察脂多糖對(duì)腦組織免疫球蛋白G含量及細(xì)胞因子的影響：昆明小白鼠隨機(jī)分為2大組：對(duì)照組(control組)和脂多糖組(LPS組),各組小鼠數(shù)見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖10mg/kg,對(duì)照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,分別于注射脂多糖8、12小時(shí)后將小鼠處死,迅速取出大腦進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。Real-time RT-PCR檢測(cè)腦組織白介素β (interleukin-1beta, IL-1β)和腫瘤壞死因子a (tumor necrosis factor alfa, TNF-α) mRNA含量,ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)蛋白含量。統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析, P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.2結(jié)果 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)6小時(shí)或12小時(shí)后,各組腦組織含水量明顯增加,和對(duì)照組相比有顯著性差異(p0.05),各脂多糖組間腦組織含水量無(wú)差異。 (2)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小時(shí),腦組織含水量明顯增加,高于對(duì)照組(p0.05),同時(shí)腦組織IgG含量增加,與對(duì)照組比較有明顯的差異(p0.05)；注射脂多糖12小時(shí)后腦組織IgG含量也明顯增加,與對(duì)照組比較有明顯的差異(p0.05),但與8小時(shí)組比較無(wú)明顯差異(p0.05)。 (3)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小時(shí)或12小時(shí),腦組織中IL-1βmRNA及蛋白的含量明顯增高,與對(duì)照組相比均有顯著差異(p0.01,p0.05)；脂多糖組間腦組織IL-1βmRNA及蛋白含量無(wú)差異；腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β一致。 1.3結(jié)論 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時(shí)后可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦水腫,增加脂多糖的作用時(shí)間延長(zhǎng)及劑量不再提高水腫的程度,表明腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時(shí)后可以成功誘導(dǎo)穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型。 (2)腹腔注射脂多糖所致腦水腫時(shí)血腦屏障通透性增高、腦組織細(xì)胞因子IL-1β和TNF-a的表達(dá)增加。 23%氯化鈉對(duì)脂多糖小鼠腦水腫的保護(hù)作用及可能機(jī)制 2.1方法 昆明小白鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(control組),脂多糖組(LPS組)和3%氯化鈉組(HS組),各組小鼠數(shù)目見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組和3%氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),對(duì)照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時(shí),對(duì)照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20ml/kg),3%氯化鈉組各尾靜脈注射3%氯化鈉(20ml/kg),尾靜脈注射3%氯化鈉或生理鹽水2小時(shí)或6小時(shí)后處死小鼠,迅速斷頭,取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢查。測(cè)定腦組織含水量,Real-time RT-PCR檢測(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、AQP-4mRNA含量,ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α和IgG蛋白含量,Western blotting檢測(cè)腦組織AQP-4蛋白含量。 統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.2結(jié)果 (1)3%氯化鈉組治療2小時(shí)后腦組織含水量明顯減少,低于脂多糖組(p0.05),治療6小時(shí)后腦組織水含量仍然低于脂多糖組,但和2小時(shí)組無(wú)明顯差異。 (2)3%氯化鈉組治療2小時(shí)后腦組織IgG含量和脂多糖組無(wú)明顯差異(p0.05)；治療6小時(shí)后3%氯化鈉組腦組織IgG含量明顯降低(p0.05),低于脂多糖組(p0.05)。 (3)3%氯化鈉組治療2小時(shí)后,腦組織中IL-1βmRNA明顯減低,與脂多糖組比較有明顯的差異(p0.01)；腦組織中IL-1β蛋白含量雖有下降趨勢(shì),但與脂多糖組比較無(wú)明顯的差異(p0.05)。3%氯化鈉組治療6小時(shí)后,腦組織中IL-1βmRNA進(jìn)一步減少(p0.01),而IL-1β蛋白無(wú)進(jìn)一步減少(p0.05),但與脂多糖組比較均有明顯的差異(p0.01)。腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β的一致。 (4)3%氯化鈉組治療2小時(shí)后,腦組織中AQP-4mRNA即明顯減低,與LPS組比較有明顯的差異(p0.01),但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng),腦組織中腦組織中AQP-4mRNA無(wú)進(jìn)一步下降現(xiàn)象,而腦組織AQP-4蛋白含量在治療2小時(shí)后雖與LPS組比較無(wú)明顯的差異(p0.05)。但隨著治療時(shí)間延長(zhǎng),腦組織中AQP-4蛋白含量明顯減少(p0.05),在3%氯化鈉組治療6小時(shí)后,腦組織中AQP-4蛋白與脂多糖組比較有明顯的差異(p0.05)。 2.3結(jié)論 (1)3%氯化鈉可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫,下調(diào)腦水腫時(shí)腦組織炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生。 (2)3%氯化鈉可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫時(shí)腦組織AQP4的表達(dá),減少炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達(dá)的機(jī)制之一。 3PKC在3%氯化鈉抑制AQP4表達(dá)中的作用 3.1方法 (1)觀察3%氯化鈉對(duì)小鼠脂多糖腦水腫時(shí)腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量的影響：昆明小白鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(control組),脂多糖組(LPS組)和3%氯化鈉組(HS組),各組小鼠數(shù)目見(jiàn)后面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。脂多糖組和3%氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),對(duì)照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時(shí),對(duì)照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20ml/kg),3%氯化鈉組各尾靜脈注射3%氯化鈉(20ml/kg),尾靜脈注射3%氯化鈉或生理鹽水2小時(shí)或6小時(shí)后處死小鼠,迅速斷頭,取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢查。Western blotting檢測(cè)腦組織腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量。 (2)觀察3%氯化鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)的影響： 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,培養(yǎng)至第四代后,第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為3大組：對(duì)照組(control組)、IL-1β組、IL-1β+HS組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,進(jìn)行相關(guān)檢查。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,Real-time RT-PCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接標(biāo)記抗體法)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面AQP-4含量。 (3)PKC抑制劑Calphostin C對(duì)3%氯化鈉誘導(dǎo)的AQP4表達(dá)變化的影響：第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6組：A.對(duì)照組(control組)；B.IL-1β組：C.IL-1β+HS組：D.IL-1β+抑制劑組；E.IL-1β+抑制劑+HS組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,進(jìn)行相關(guān)檢查。Real-time RT-PCR檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接標(biāo)記抗體法)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面AQP-4含量。 統(tǒng)計(jì)方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.2結(jié)果 (1) IL-1β組及IL-1β+HS組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 (2)脂多糖組腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量無(wú)明顯變化,與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P0.05)；3%氯化鈉組治療后6小時(shí),腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量明顯增高,明顯高于脂多糖組及對(duì)照組(P0.05)。 (3)用含IL-1β (5ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)后,星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA及蛋白含量明顯增加,與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p0.01)。 (4) IL-1β+HS組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA含量低于IL-1β組,與IL-1β組比較有顯著差異(p0.01)；星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白含量變化規(guī)律與AQP4mRNA一致。 (5) PKCa抑制劑+HS組星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4mRNA含量明顯高于IL-1β+HS組(p0.01),但仍低于IL-1β組(p0.01)；星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白含量變化規(guī)律與AQP4mRNA一致。 3.3結(jié)論 (1)3%氯化鈉可抑制IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和蛋白表達(dá)。 (2)3%氯化鈉可能通過(guò)激活PKC而抑制IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)論 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時(shí)后可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦水腫,成功建立了穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型；脂多糖所致腦水腫時(shí)血腦屏障通透性增高、腦組織細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)增加。 (2)3%氯化鈉可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫,下調(diào)腦水腫時(shí)腦組織炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生。 (3)3%氯化鈉可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腦水腫時(shí)腦組織AQP4的表達(dá),減少炎癥因子的表達(dá)和產(chǎn)生可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達(dá)的機(jī)制之一。 (4)3%氯化鈉可抑制IL-1β誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4mRNA和蛋白表達(dá),激活PKC可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達(dá)的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742

【參考文獻(xiàn)】

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1 王懷立,蘆軍萍,羅強(qiáng),高鐵錚;TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠腦水腫發(fā)生中的變化和意義[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2003年01期

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本文編號(hào)：1627089