發(fā)布時間：2018-03-18 00:05

  本文選題：3%氯化鈉　切入點：高滲鹽水　出處：《中南大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景 腦水腫是臨床常見危急重癥。由腦水腫所引起的顱內(nèi)高壓可引起腦血流的減少和繼發(fā)性缺血性腦損傷的發(fā)生,也可引起腦疝的形成而危及生命。高滲鈉溶液在臨床上已廣泛應用于腦外傷、腦出血、腦梗塞所致腦水腫等的治療。目前常用的高滲鈉濃度有3%、5%、7.5%、10%、23.4%,大量臨床及動物實驗研究均證實了其療效.近年來大量文獻報道,證實高滲鈉溶液治療腦水腫的療效優(yōu)于甘露醇,而且其副作用少。 高滲鈉治療腦水腫具體的機制尚不完全清楚,其可能的機制有(1)滲透性作用；(2)增加局部腦組織灌注；(3)減輕腦損傷后的炎癥反應；(4)恢復細胞膜Na+,K+-ATP酶活性等。Zeng HK在大鼠缺血性腦損傷模型上發(fā)現(xiàn)10%氯化鈉可下調(diào)星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)的表達。本研究組前期實驗發(fā)現(xiàn)3%氯化鈉可下調(diào)兔大腸桿菌腦膜炎腦組織AQP4的表達。這提示3%氯化鈉可能通過下調(diào)AQP4的表達減輕腦水腫。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是大腸桿菌細胞壁上的主要成分,也是其主要的致病成分,與腦水腫的發(fā)生密切相關。本研究進一步觀察3%氯化鈉對脂多糖所致腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達的影響,探討3%氯化鈉治療腦水腫的非滲透機制。 目的 (1)觀察3%氯化鈉對脂多糖小鼠腦水腫及腦組織炎癥因子、AQP4表達的影響,探討3%氯化鈉治療脂多糖小鼠腦水腫的非滲透機制。 (2)在細胞水平探討蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)在3%氯化鈉下調(diào)AQP4表達中的作用。1建立小鼠脂多糖腦水腫模型 1.1方法 (1)觀察脂多糖對腦組織含水量變化的時效和量效作用：昆明小白鼠隨機分為2大組：對照組(control組)和脂多糖組(LPS組),各組小鼠數(shù)見后面實驗結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10、20、40mg/kg),對照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,分別于脂多糖注射6、12小時后將小鼠處死,迅速取出大腦進行含水量測定。 (2)觀察脂多糖對腦組織免疫球蛋白G含量及細胞因子的影響：昆明小白鼠隨機分為2大組：對照組(control組)和脂多糖組(LPS組),各組小鼠數(shù)見后面實驗結(jié)果中。脂多糖組小鼠予以腹腔注射脂多糖10mg/kg,對照組小鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,分別于注射脂多糖8、12小時后將小鼠處死,迅速取出大腦進行相關測定。Real-time RT-PCR檢測腦組織白介素β (interleukin-1beta, IL-1β)和腫瘤壞死因子a (tumor necrosis factor alfa, TNF-α) mRNA含量,ELISA法檢測IL-1β、TNF-α和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)蛋白含量。統(tǒng)計方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設計的單因素方差分析, P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 1.2結(jié)果 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)6小時或12小時后,各組腦組織含水量明顯增加,和對照組相比有顯著性差異(p0.05),各脂多糖組間腦組織含水量無差異。 (2)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小時,腦組織含水量明顯增加,高于對照組(p0.05),同時腦組織IgG含量增加,與對照組比較有明顯的差異(p0.05)；注射脂多糖12小時后腦組織IgG含量也明顯增加,與對照組比較有明顯的差異(p0.05),但與8小時組比較無明顯差異(p0.05)。 (3)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小時或12小時,腦組織中IL-1βmRNA及蛋白的含量明顯增高,與對照組相比均有顯著差異(p0.01,p0.05)；脂多糖組間腦組織IL-1βmRNA及蛋白含量無差異；腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β一致。 1.3結(jié)論 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時后可誘導產(chǎn)生腦水腫,增加脂多糖的作用時間延長及劑量不再提高水腫的程度,表明腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時后可以成功誘導穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型。 (2)腹腔注射脂多糖所致腦水腫時血腦屏障通透性增高、腦組織細胞因子IL-1β和TNF-a的表達增加。 23%氯化鈉對脂多糖小鼠腦水腫的保護作用及可能機制 2.1方法 昆明小白鼠隨機分為3組：對照組(control組),脂多糖組(LPS組)和3%氯化鈉組(HS組),各組小鼠數(shù)目見后面實驗結(jié)果中。脂多糖組和3%氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),對照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時,對照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20ml/kg),3%氯化鈉組各尾靜脈注射3%氯化鈉(20ml/kg),尾靜脈注射3%氯化鈉或生理鹽水2小時或6小時后處死小鼠,迅速斷頭,取腦組織進行相關檢查。測定腦組織含水量,Real-time RT-PCR檢測腦組織IL-1β、TNF-α、AQP-4mRNA含量,ELISA法檢測IL-1β、TNF-α和IgG蛋白含量,Western blotting檢測腦組織AQP-4蛋白含量。 統(tǒng)計方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設計的單因素方差分析,P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 2.2結(jié)果 (1)3%氯化鈉組治療2小時后腦組織含水量明顯減少,低于脂多糖組(p0.05),治療6小時后腦組織水含量仍然低于脂多糖組,但和2小時組無明顯差異。 (2)3%氯化鈉組治療2小時后腦組織IgG含量和脂多糖組無明顯差異(p0.05)；治療6小時后3%氯化鈉組腦組織IgG含量明顯降低(p0.05),低于脂多糖組(p0.05)。 (3)3%氯化鈉組治療2小時后,腦組織中IL-1βmRNA明顯減低,與脂多糖組比較有明顯的差異(p0.01)；腦組織中IL-1β蛋白含量雖有下降趨勢,但與脂多糖組比較無明顯的差異(p0.05)。3%氯化鈉組治療6小時后,腦組織中IL-1βmRNA進一步減少(p0.01),而IL-1β蛋白無進一步減少(p0.05),但與脂多糖組比較均有明顯的差異(p0.01)。腦組織中TNF-αmRNA及蛋白含量的變化規(guī)律與IL-1β的一致。 (4)3%氯化鈉組治療2小時后,腦組織中AQP-4mRNA即明顯減低,與LPS組比較有明顯的差異(p0.01),但隨著治療時間延長,腦組織中腦組織中AQP-4mRNA無進一步下降現(xiàn)象,而腦組織AQP-4蛋白含量在治療2小時后雖與LPS組比較無明顯的差異(p0.05)。但隨著治療時間延長,腦組織中AQP-4蛋白含量明顯減少(p0.05),在3%氯化鈉組治療6小時后,腦組織中AQP-4蛋白與脂多糖組比較有明顯的差異(p0.05)。 2.3結(jié)論 (1)3%氯化鈉可減輕脂多糖誘導的小鼠腦水腫,下調(diào)腦水腫時腦組織炎癥因子的表達和產(chǎn)生。 (2)3%氯化鈉可抑制脂多糖誘導的小鼠腦水腫時腦組織AQP4的表達,減少炎癥因子的表達和產(chǎn)生可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達的機制之一。 3PKC在3%氯化鈉抑制AQP4表達中的作用 3.1方法 (1)觀察3%氯化鈉對小鼠脂多糖腦水腫時腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量的影響：昆明小白鼠隨機分為3組：對照組(control組),脂多糖組(LPS組)和3%氯化鈉組(HS組),各組小鼠數(shù)目見后面實驗結(jié)果中。脂多糖組和3%氯化鈉組小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),對照組小鼠予以腹腔注射相同劑量的生理鹽水。于脂多糖注射后6小時,對照組和脂多糖組尾靜脈注射生理鹽水(20ml/kg),3%氯化鈉組各尾靜脈注射3%氯化鈉(20ml/kg),尾靜脈注射3%氯化鈉或生理鹽水2小時或6小時后處死小鼠,迅速斷頭,取腦組織進行相關檢查。Western blotting檢測腦組織腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量。 (2)觀察3%氯化鈉對IL-1β誘導的星形膠質(zhì)細胞AQP4表達的影響： 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,培養(yǎng)至第四代后,第四代星形膠質(zhì)細胞隨機分為3大組：對照組(control組)、IL-1β組、IL-1β+HS組。實驗結(jié)束后,進行相關檢查。MTT法檢測細胞存活率,Real-time RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接標記抗體法)檢測星形膠質(zhì)細胞膜表面AQP-4含量。 (3)PKC抑制劑Calphostin C對3%氯化鈉誘導的AQP4表達變化的影響：第四代星形膠質(zhì)細胞隨機分為6組：A.對照組(control組)；B.IL-1β組：C.IL-1β+HS組：D.IL-1β+抑制劑組；E.IL-1β+抑制劑+HS組。實驗結(jié)束后,進行相關檢查。Real-time RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接標記抗體法)檢測星形膠質(zhì)細胞膜表面AQP-4含量。 統(tǒng)計方法兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設計的單因素方差分析,P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 3.2結(jié)果 (1) IL-1β組及IL-1β+HS組與對照組比較細胞存活率無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 (2)脂多糖組腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量無明顯變化,與對照組比較無顯著差異(P0.05)；3%氯化鈉組治療后6小時,腦組織膜性結(jié)構(gòu)中PKCa含量明顯增高,明顯高于脂多糖組及對照組(P0.05)。 (3)用含IL-1β (5ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時后,星形膠質(zhì)細胞AQP-4mRNA及蛋白含量明顯增加,與對照組相比均有顯著性差異(p0.01)。 (4) IL-1β+HS組星形膠質(zhì)細胞AQP4mRNA含量低于IL-1β組,與IL-1β組比較有顯著差異(p0.01)；星形膠質(zhì)細胞AQP4蛋白含量變化規(guī)律與AQP4mRNA一致。 (5) PKCa抑制劑+HS組星形膠質(zhì)細胞AQP-4mRNA含量明顯高于IL-1β+HS組(p0.01),但仍低于IL-1β組(p0.01)；星形膠質(zhì)細胞蛋白含量變化規(guī)律與AQP4mRNA一致。 3.3結(jié)論 (1)3%氯化鈉可抑制IL-1β誘導的星形膠質(zhì)細胞AQP4mRNA和蛋白表達。 (2)3%氯化鈉可能通過激活PKC而抑制IL-1β誘導的星形膠質(zhì)細胞AQP4mRNA和蛋白表達。 結(jié)論 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小時后可誘導產(chǎn)生腦水腫,成功建立了穩(wěn)定的脂多糖腦水腫模型；脂多糖所致腦水腫時血腦屏障通透性增高、腦組織細胞因子IL-1β和TNF-α的表達增加。 (2)3%氯化鈉可減輕脂多糖誘導的小鼠腦水腫,下調(diào)腦水腫時腦組織炎癥因子的表達和產(chǎn)生。 (3)3%氯化鈉可抑制脂多糖誘導的小鼠腦水腫時腦組織AQP4的表達,減少炎癥因子的表達和產(chǎn)生可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達的機制之一。 (4)3%氯化鈉可抑制IL-1β誘導的星形膠質(zhì)細胞AQP4mRNA和蛋白表達,激活PKC可能是3%氯化鈉抑制AQP4表達的機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 王懷立,蘆軍萍,羅強,高鐵錚;TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠腦水腫發(fā)生中的變化和意義[J];中國免疫學雜志;2003年01期

，

本文編號：1627089