本文選題：尿囊腔動脈　切入點：腦血管痙攣　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:腦血管痙攣(CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后致死致殘的主要原因。預(yù)防及治療CVS一直是提高SAH患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。對于CVS的發(fā)病機制及藥物治療的研究多基于各種動物模型,差異性很大,存在多種假設(shè),尚沒有一種動物模型能夠完全模擬人類SAH后CVS的特點。Yu等在2011年首次報道了使用氧合血紅蛋白刺激雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管痙攣模擬CVS變化的實驗研究。我們在重復(fù)雞胚CAM血管痙攣模型時發(fā)現(xiàn)雞胚尿囊腔動脈(Allantoic cavity artery,ACA)所處的液體環(huán)境與人腦血管所處的蛛網(wǎng)膜下腔液體環(huán)境很相似,附于蛋殼內(nèi)面的雞胚CAM血管在燈光照射下清晰可見,通過針刺即可以造成尿囊腔內(nèi)出血,操作方便,容易觀察。基于雞胚ACA的這種特點,我們嘗試通過針刺CAM血管引起雞胚尿囊腔內(nèi)出血,觀察是否可以誘導雞胚ACA的血管痙攣,模擬SAH出血后CVS的病理變化。甘草酸苷(GL)是甘草屬植物根莖提取物的有效成分,具有廣泛的生物學活性,包括抗炎癥反應(yīng),抗氧化應(yīng)激及自由基清除等作用。有學者報道了甘草酸苷在缺血再灌注損傷中的應(yīng)用,研究結(jié)果顯示GL能夠顯著的降低小鼠大腦中動脈梗塞模型的梗死面積,改善神經(jīng)功能,抑制腦水腫,并能降低腦組織中TNF-a,IL-6,COX-2,i NOS,NF-kB及GFAP的表達水平,顯示GL的神經(jīng)保護功能主要跟其抗炎抗氧化應(yīng)激功能相關(guān)。但是GL在SAH后CVS的應(yīng)用研究較少,我們在成功構(gòu)建的針刺雞胚CAM血管致尿囊腔出血誘導ACA血管痙攣模型的基礎(chǔ)上,驗證了不同劑量的GL在治療雞胚ACA血管痙攣模型中的作用效果,并通過蛋白電泳的方法檢測了氧化應(yīng)激相關(guān)指標,炎癥反應(yīng)相關(guān)因子,細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK通路蛋白的表達變化,闡述了GL治療雞胚ACA血管痙攣的可能機制。研究目的:嘗試建立基于雞胚ACA的一種新的腦血管痙攣研究模型,并驗證GL在ACA血管痙攣模型中的治療作用,闡述相關(guān)機制。研究方法:(1)通過解剖11日齡雞胚,尿囊腔注射美蘭實驗,病理切片及透射電鏡(TEM)的方法觀察雞胚尿囊腔及ACA血管的組織結(jié)構(gòu)特點,探討了雞胚ACA血管模擬SAH后CVS的解剖學基礎(chǔ)。(2)180只SPF級新鮮雞胚種蛋,隨機分為正常對照(Control)組40只,假手術(shù)(Sham)組40只,實驗?zāi)Ｐ?Model)組80只,各組再隨機等分為1day、3day、5day、7day四個亞組,其余備用。孵化至11日齡時,Model組先使用16G注射器針頭輕輕鉆破蛋殼,不要傷及CAM血管,然后使用26 G注射器針頭刺破CAM血管,照蛋燈下能看到明顯的出血,輕輕轉(zhuǎn)動雞胚,讓血液在尿囊腔內(nèi)均勻彌散,嘗試建立雞胚尿囊腔出血誘導的ACA血管痙攣模型。Sham組僅用16G注射器針頭鉆破蛋殼,不刺破CAM血管,Control組不做任何操作。(3)分別于造模后1day,3day,5day,7day處死雞胚,獲取Control組,Sham組及Model組尿囊液及ACA血管標本,通過組織切片,免疫組化,TUNEL染色,透射電鏡(TEM)檢查,蛋白電泳等方法,觀察ACA血管內(nèi)徑橫截面積、管壁厚度及管壁超微結(jié)構(gòu)的變化,尿囊腔內(nèi)血紅蛋白濃度的變化,及ACA組織內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白,炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白,凋亡相關(guān)蛋白表達水平的變化。(4)120只SPF級新鮮雞胚種蛋,隨機分為假手術(shù)(Sham)組,實驗?zāi)Ｐ?Model)組,實驗?zāi)Ｐ?0.9%生理鹽水(Model+NS)組,實驗?zāi)Ｐ?低劑量GL(Model+3μg GL)組,實驗?zāi)Ｐ?高劑量GL(Model+6μg GL)組,每組20只,其余備用。孵化至11日齡時,通過針刺CAM血管方法造模,Sham組不刺破CAM血管。造模后即刻,Model+NS組,每日給予10μl/g的0.9%生理鹽水;Model+3μg GL組,每日給予10μl/g的0.3μg/μl的GL0.9%生理鹽水溶液;Model+6μg GL組每日給予10μl/g的0.6μg/μl的GL0.9%生理鹽水溶液,以上分劑量均分兩次給藥,12h一次。Sham組及Model組不給藥。在造模后5day處死雞胚,分別獲取各組ACA血管標本,通過病理切片觀察不同劑量的GL對雞胚ACA血管內(nèi)徑橫截面積及管壁厚度的影響,并通過蛋白電泳的方法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標,炎癥反應(yīng)相關(guān)因子,細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK通路蛋白的表達變化,闡述GL治療雞胚ACA血管痙攣的可能機制。結(jié)果:(1)雞胚ACA血管所處的液體環(huán)境與人類wills環(huán)動脈血管所處的蛛網(wǎng)膜下腔環(huán)境相似,尿囊腔注射美蘭可見ACA著色,ACA在病理學組織結(jié)構(gòu)特點上與人類腦動脈血管接近。(2)尿囊腔出血模型(Model)組雞胚的死亡率顯著增加。(3)Model組在造模后3day,5day,7day時,ACA血管內(nèi)徑橫截面積明顯減小,管壁厚度明顯增加。(4)TUNEL染色及TEM觀察結(jié)果顯示:Model組ACA血管細胞凋亡指數(shù)顯著增高,內(nèi)皮細胞排列疏松,失去細胞間正常的連接,細胞核核質(zhì)碎裂,向核膜周邊聚集,內(nèi)皮下彈力層可見波浪形皺褶,管壁內(nèi)可見炎性細胞的浸潤。(5)Model組氧合血紅蛋白及脫氧血紅蛋白濃度與ACA血管內(nèi)徑橫截面積及管壁厚度的變化趨勢相一致。(6)Model組ACA組織內(nèi)SOD,GR,CAT的活性及表達水平明顯下降,i NOS表達水平明顯增高,MDA濃度顯著升高;IL-6,IL-1b及TNF-a表達水平增高;PCNA表達水平增高,a-SMA在造模后5day表達水平下降;ET-1及ETRA的表達水平升高;HIF-1a及VEGF的表達水平亦明顯增高;C-Caspase3表達水平升高,而Bcl-2表達水平下調(diào)。(7)GL能夠明顯提高尿囊腔出血模型雞胚的存活率。(8)GL能夠緩解尿囊腔出血后ACA血管痙攣,高劑量組更加顯著,但不能完全逆轉(zhuǎn)。(9)GL能夠緩解尿囊腔出血模型后ACA組織內(nèi)SOD,GR,CAT的表達水平下降及i NOS表達水平增高;緩解IL-6,IL-1b及TNF-a表達水平增高;緩解C-Caspase3的表達水平升高及Bcl-2表達水平下調(diào);以及緩解MAPK信號通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表達水平比例的升高,高劑量組更加明顯;GL不影響p-ERK/ERK蛋白表達水平比例的變化。結(jié)論:(1)雞胚ACA所處的液體環(huán)境與人類wills環(huán)動脈血管所處的蛛網(wǎng)膜下腔環(huán)境相似,組織結(jié)構(gòu)上也與人類腦動脈血管接近,是模擬SAH后CVS的解剖學基礎(chǔ)。(2)雞胚尿囊腔出血模型能夠誘導ACA出現(xiàn)與人類SAH后CVS相似的病理學改變,為CVS的研究提供一種新的模型選擇。(3)尿囊腔出血后血紅蛋白代謝過程、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化等參與ACA血管痙攣的發(fā)生。(4)GL能夠緩解尿囊腔出血后ACA組織中的氧化應(yīng)激,炎癥反應(yīng)及細胞凋亡水平,提高尿囊腔出血模型雞胚的存活率,改善ACA的血管痙攣。(5)GL對尿囊腔出血后ACA血管痙攣的緩解作用依賴于對MAPK信號通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表達的影響。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3;R-332

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