本文選題：替莫唑胺　切入點：膠質(zhì)瘤　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、目的： 細胞老化(Cellular Senescence)是一種與衰老發(fā)生、腫瘤生成與進展、壓力應激、損傷修復等多種人體生理病理過程廣泛相關的細胞程序。近年來的研究表明,在腫瘤化學治療中,腫瘤細胞常常維持正常的生理活動及代謝,停止分裂增殖,表現(xiàn)出細胞老化的表型以應對化學藥物的作用。經(jīng)過細胞毒藥物處理的老化腫瘤細胞以長期的細胞分裂周期暫停,較低的增殖能力和侵襲能力為特征,可以被衰老相關的半乳糖苷酶染色所標記。盡管誘導細胞老化的藥物作用機制各不相同,細胞老化廣泛在各種不同細胞背景的藥物治療中都有所發(fā)現(xiàn)。替莫唑胺作為惡性膠質(zhì)瘤一線化療藥物,也在近年來的研究中也顯示了非常典型的細胞老化誘導作用。作為烷化劑類藥物,替莫唑胺對DNA加甲基化產(chǎn)生包括O6-MeG等損傷位點,這些DNA損傷可以雙向誘導凋亡或者是細胞老化。然而具體的介導細胞不同反應的內(nèi)在機制卻尚未明了。 細胞老化與凋亡同樣是替莫唑胺臨床療效在細胞水平上的具體表現(xiàn)。老化的膠質(zhì)瘤細胞阻斷了腫瘤的快速生長及侵襲和血管生成能力。特別考慮到替莫唑胺所能誘導的凋亡作用實際上相當有限,細胞老化對于替莫唑胺臨床療效的作用就更為重要了。但是,不同與凋亡徹底殺滅腫瘤細胞,老化的膠質(zhì)瘤細胞仍然保持了一定的活力,同時細胞分裂增殖的停滯也阻斷了替莫唑胺作為基因毒藥物通過DNA的分裂復制擴大DNA損傷的作用。對于老化細胞長期命運的研究表明,細胞老化也并不是永久的細胞生長停滯,細胞有可能在一定的時間內(nèi)通過老化逃脫(Senescence escape)擺脫老化狀態(tài),重新增殖,從而使腫瘤復發(fā)。 基于對細胞老化可逆性(Reversibility of senescence)的考量,如果能減少替莫唑胺誘導的細胞老化促使膠質(zhì)瘤細胞凋亡,或者阻斷老化細胞的逃脫,那么替莫唑胺的療效將可能進一步提升。雖然有關細胞老化發(fā)生和維持的確切機制尚未能完全明了,既往的研究顯示增殖和凋亡的相關細胞信號通路可能參與到細胞老化的調(diào)控中。這本質(zhì)上也是協(xié)調(diào)各種細胞進程,避免相互矛盾的信號指令的需要。舉例來說,當細胞決定進入老化狀態(tài)的時候,凋亡和增殖的相關作用就會被抑制。Bcl-2作為抗凋亡基因就能夠抑制細胞凋亡并且誘導細胞老化。本文著重對另一種抗凋亡蛋白,survivin的相關作用做進一步探討。survivin是一種多功能的IAP家族蛋白,主要在胚胎及腫瘤組織中表達,介導細胞凋亡抵抗及細胞周期進程的推動。早期的研究表明survivin可以保護腫瘤細胞免受化療藥物誘導的凋亡作用及促進細胞增殖�；谝陨献C據(jù),我們認為survivin有可能在膠質(zhì)瘤替莫唑胺治療中促進凋亡抵抗及老化細胞重新增殖。為此,本文采用干擾RNA抑制survivin在膠質(zhì)瘤細胞中的表達并探索其在替莫唑胺誘導的細胞凋亡及老化中的效應。 二、方法： 1.細胞培養(yǎng) U251和U87細胞調(diào)合適濃度接種于6孔板或96孔板,加入含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞生長至良好狀態(tài)和濃度用于后續(xù)實驗。 2.替莫唑胺干預細胞 細胞生長至合適的濃度和狀態(tài),根據(jù)不同的實驗目的和要求,用不同濃度的替莫唑胺干預U251、U87細胞24小時,進行相關檢測,選取合適的劑量用于進行后續(xù)實驗。 3.MTT檢測細胞活力 按照1×104/孔的濃度將細胞接種于九十六孔板,按實驗分組給予相應的處理因素,每組設6個復孔。處理終止后,用移液器吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入D-hanks溶液輕輕洗3次,每次洗3min,然后每孔加入MTT溶液(濃度為5g/L,現(xiàn)用現(xiàn)配)20gL,再每孔補加100μL無血清的DMEM培養(yǎng)液,于5%C0237℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4h后,終止培養(yǎng),慢慢吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基。然后每孔加入150μL的DMSO,室溫震蕩10min使藍紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解,在酶標儀490nm處測其OD值并計算各組細胞存活率。 4.β-半乳糖苷酶染色觀察細胞老化 吸除6孔板中的細胞培養(yǎng)液,用PBS輕柔洗滌1次,加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液,室溫下固定15分鐘。吸除細胞固定液,用PBS洗滌細胞3次,每次3分鐘。吸除PBS,每孔加入1毫升染色工作液(見染色工作液的配制)。37℃孵育過夜,可以用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。注意37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進行。孵育完成后吸除工作液,加入2毫升PBS,普通光學顯微鏡下觀察計數(shù)。 染色工作液的配制：p-半乳糖苷酶染色液A10μl±p-半乳糖苷酶染色液B10μl-半乳糖苷酶染色液C930μl+X-Gal溶液50μl,使用聚丙烯(polypropylene)容器,不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制。 5.流式細胞儀檢測 細胞調(diào)整合適2×105/孔的濃度接種至六孔板,按實驗分組進行相應處理后,用PBS洗滌細胞一次后離心(2000rpm,5min)收集并使用用體積分數(shù)為70%的乙醇固定單細胞懸液,4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ旧坝肞BS洗去固定液；加100pL RNase A37℃水浴30min避免RNA干擾；每份樣本中加入400μL PI染色混勻,4℃避光30min后上機檢測,記錄激發(fā)波長為488nm處紅色熒光。在細胞分選實驗中,活細胞按說明書使用Ruby染色(Invitrogen)上機檢測DNA含量,達到預設DNA含量標準的細胞被篩選后離心收集(2000rpm,5min),并接種全血清培養(yǎng)皿進一步進行集落生成實驗。 細胞調(diào)整至合適2×105/孔的濃度接種至六孔板,按實驗分組進行相應處理后,細胞用不含EDTA的胰酶短暫消化后收集,然后用PBS洗滌重懸細胞2次(2000rpm離心5min)；加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞,再加入5μLAnnexin V-FITC于細胞懸液中,用移液器輕輕混勻,最后加入5μL Propidium Iodide;將樣本處于室溫、避光處反應5～15min,再進行流式細胞儀進行檢測(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長530nm)。PI紅色熒光通過PI通道；Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測。使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞作為對照,進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。分別計算凋亡細胞及壞死細胞占總細胞的比率,每組實驗樣本重復三次以上。 7. Western blot檢測細胞蛋白表達 細胞按實驗分組處理完成后,以Western及IP細胞裂解液提取腫瘤細胞蛋白,BCA法進行蛋白定量,進行蛋白印跡實驗。以Actin為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分離,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,孵育一抗和二抗,ECL顯色,KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測定并分析條帶灰度值以檢測目的蛋白的表達水平。 8. SiRNA干擾 調(diào)合適的細胞濃度分別接種于六孔板或二十四孔板中,取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計提供,打開離心管前先離心,然后再慢慢打開管蓋,溶解時加適量DEPC水后蓋上管蓋,振蕩溶解,使用150ul附送的DEPC水重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。使用GIBCO提供的lip2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天,在不包含抗生素的適量的培養(yǎng)基中接種細胞,轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度要達到30-50%。將寡聚物-LipofectamineTM2000復合物加入到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。37℃,C02培養(yǎng)箱孵育24-96小時,直到適合進行基因阻斷分析。 9.細胞集落生成實驗 對指數(shù)生長期細胞,采用常規(guī)消化傳代方法,制成細胞懸液。細胞懸液反復吹打,使細胞充分分散,單個細胞百分率應在95%以上。細胞記數(shù),并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度,待用。根據(jù)細胞增殖能力,將細胞懸液倍比稀釋。一般按照10%的培養(yǎng)密度接種5ml細胞懸液到培養(yǎng)皿(直徑60mm)中,以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿,使細胞分散均勻。培養(yǎng)皿置37℃、5%C02中培養(yǎng)2-3周,中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時更換新鮮培養(yǎng)液。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時,終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,PBS液小心浸洗2次,空氣干燥。甲醇固定15分鐘,棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘,流水緩慢洗去染液,空氣干燥。 10.統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。本實驗數(shù)據(jù)屬于完全隨機設計的計量資料,故采用單因素方差分析one—way ANOVA進行方差分析,方差齊時采用LSD法進行組間多重比較,方差不齊時采用Dunnett's T3法進行組間多重比較,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。P0.05為有顯著性差異。 三、結(jié)果： 1. survivin干擾增加U251膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性 替莫唑胺具有雙向誘導細胞凋亡及細胞老化的作用,在100μM左右的臨床相關劑量單次處理U251膠質(zhì)瘤細胞可以在一周內(nèi)觀察到明顯的細胞凋亡及老化的反應。為了研究survivin在替莫唑胺誘導的細胞老化及凋亡中的作用,我們采用小干擾RNA對U251細胞中的survivin進行干擾,以隨機對照序列作為參照。由免疫印跡法檢測U251中的survivin的表達,替莫唑胺處理后的U251細胞中的survivin處于穩(wěn)定表達的狀態(tài),經(jīng)干擾survivin的SiRNA處理的實驗組細胞survivin表達被明顯抑制,而對照組無變化。 實驗組細胞和對照經(jīng)過替莫唑胺處理后的生長曲線表明survivin干擾增加U251膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性,實驗組細胞相較對照早期出現(xiàn)明顯的細胞數(shù)目下降,并在一周左右的時間內(nèi)出現(xiàn)細胞生長停滯,將細胞數(shù)目穩(wěn)定在一個相對較低的水平內(nèi)。進一步的流式細胞分析凋亡細胞比例及周期分布顯示實驗組早期細胞數(shù)目的下降是由于凋亡細胞比例的增加,而細胞生長停滯的原因則是因為之后出現(xiàn)G2/M分裂間期細胞數(shù)目和半乳糖苷酶染色陽性的老化細胞數(shù)目的上升。以上結(jié)果提示,survivin促進了膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的化療抵抗,沉默survivin的表達使U251對替莫唑胺的反應由細胞老化轉(zhuǎn)向凋亡。 2.替莫唑胺誘導的老化U251細胞長期培養(yǎng)后的再增殖和老化逃脫 細胞老化以往被定義為一種不可逆的細胞進程,即細胞無法再獲得增殖能力。近年來的研究表明,對于失去自我增殖調(diào)控、快速增殖的腫瘤細胞,可以在老化后長時間培養(yǎng)中再次獲得自我更新(self-renewal)的能力。為此,我們使用Ruby染色流式分選TMZ處理后的老化細胞,并從這些老化細胞的長期培養(yǎng)中建立了兩個可以穩(wěn)定增殖的老化逃脫(senescence escape)細胞亞克隆,SE3-U251及SE5-U251,用以研究膠質(zhì)瘤細胞老化逃脫的現(xiàn)象。 使用免疫印跡法檢測SE3-U251及SE5-U251的蛋白表達發(fā)現(xiàn)明顯的survivin表達上升,相較其老化的父輩細胞,這兩只老化逃脫的細胞對替莫唑胺的治療也顯得更為抵抗,流式細胞檢測凋亡比例發(fā)現(xiàn)替莫唑胺誘導的凋亡在SE3-U251及SE5-U251細胞明顯下降。本章研究說明替莫唑胺誘導的老化膠質(zhì)瘤細胞可通過長期培養(yǎng)自行獲得再次增殖的能力,其衍生的老化逃亡高表達survivin并開始對替莫唑胺誘導的凋亡抵抗,提示survivin在細胞老化逃脫過程中有重要作用。 3.Survivin促進U251細胞老化逃脫。 為了進一步闡述survivin在U251細胞老化逃脫的作用,我們將針對survivin的小干擾RNA轉(zhuǎn)染至替莫唑胺誘導的已經(jīng)老化的U251細胞之中,并集落生成實驗分別檢測細胞凋亡及增殖潛力。結(jié)果顯示：但顯著抑制了細胞集落的生成,周期檢測進一步說明survivin的表達能夠使部分細胞恢復S期的分布。以上實驗說明了survivin在膠質(zhì)瘤細胞老化逃脫的促進作用。 4.抑制U87細胞的survivin表達促進替莫唑胺誘導的p53依賴的凋亡發(fā)生。 p53是介導細胞內(nèi)外界壓力反應的重要抑癌蛋白,能夠阻斷細胞周期進程及誘導凋亡。在發(fā)病年齡較大的膠質(zhì)瘤患者及原發(fā)性膠質(zhì)瘤病例中,有很大一部分腫瘤組織表達完整的野生型p53。大體上p53承擔與survivin大致相反的細胞功能。之前的研究還顯示,激活p53能夠直接結(jié)合survivin啟動子對其進行負向調(diào)節(jié)。這說明腫瘤細胞的p53蛋白表型有可能決定自身survivin能否表達以致發(fā)揮作用,也將影響survivin靶向干預的效果。為了能進一步揭示survivin與p53潛在相互作用,以及兩者與替莫唑胺誘導的凋亡間的關系。我們選擇表達野生型p53的U87細胞進行后續(xù)研究。 免疫印跡法檢測U87蛋白表達顯示替莫唑胺能夠充分誘導p53蛋白表達與激活(p21蛋白的轉(zhuǎn)錄激活),但使用干擾RNA抑制U87細胞的p53及survivin表達顯示兩者間并無直接的調(diào)控關系。與上文結(jié)果一致,抑制survivin表達增加U87對替莫唑胺的敏感性及凋亡反應,而混合轉(zhuǎn)染p53及survivin干擾RNA的細胞則能部分免于替莫唑胺的凋亡誘導。綜合上述結(jié)果說明,抑制survivin導致的凋亡增加依賴于p53的表達,顯示在U87細胞中,survivin可以拮抗由替莫唑胺激活的p53誘導凋亡的作用。 四、結(jié)論： 1.細胞老化而非凋亡是替莫唑胺作用膠質(zhì)瘤細胞最主要的反應。 2. survivin干擾增加膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性,主要表現(xiàn)為早期發(fā)生凋亡反應及老化細胞的生成減少。 3.老化膠質(zhì)瘤細胞長期培養(yǎng)后可以逃脫增殖停滯并重新擴增,老化逃脫的細胞對替莫唑胺誘導的凋亡進一步抵抗。 4. Survivin促進U251細胞老化逃脫。 5.抑制U87細胞的survivin表達促進替莫唑胺誘導的p53依賴的凋亡發(fā)生
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41
，

本文編號：1625349