本文選題：原鈣粘蛋白　切入點：子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在大腦皮層的發(fā)育過程中,皮層神經(jīng)元是由位于大腦皮層側(cè)腦室表層室管膜區(qū)和亞室管膜區(qū)的神經(jīng)干細胞分裂產(chǎn)生的,并沿著暫時存在的放射狀膠質(zhì)細胞的纖維向皮層遠端遷移,最后定居于固定細胞層,并最終參與產(chǎn)生結(jié)構(gòu)嚴整的大腦皮層。從放射狀前體細胞,至中間前體細胞,直至最終遷移至皮層板分化產(chǎn)生皮層神經(jīng)元,這幾個階段是序列產(chǎn)生的,每個階段都有其特異性的標(biāo)記物(Pax6, Tbr2, Tbr1等)。 已有研究表明成體干細胞的周圍,存在著大量具有特定功能的細胞,它們提供了干細胞賴以生存的各種物質(zhì)基礎(chǔ),對干細胞的自我更新和分化能力具有調(diào)控作用。胚胎期室管膜區(qū)和亞室管膜區(qū)存在大量的神經(jīng)干細胞,它們周圍存在的微環(huán)境是否同樣對神經(jīng)干細胞增殖、分化功能發(fā)揮調(diào)控作用,以及通過何種機制發(fā)揮作用,尚未可知。研究發(fā)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)干細胞干性的維持與周圍環(huán)境之間可能存在某種聯(lián)系,因此,研究神經(jīng)干細胞與周圍環(huán)境之間發(fā)生聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ),對于深刻理解神經(jīng)干細胞具有自我更新及分化能力的發(fā)生機制具有關(guān)鍵性作用。Anjen Chenn研究小組的實驗結(jié)果提示,鈣粘蛋白可能是神經(jīng)干細胞與周圍環(huán)境發(fā)生聯(lián)系的重要物質(zhì)基礎(chǔ),結(jié)合近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),無論是果蠅生殖系統(tǒng)的干細胞還是骨髓環(huán)境中的造血干細胞,均通過粘附連接的形式與周圍環(huán)境發(fā)生聯(lián)系。因此,本課題對鈣粘蛋白進行深入研究對于了解干細胞干性維持的分子機制具有非常重要的生理意義。 鈣粘蛋白不僅在干細胞干性維持過程中發(fā)揮作用,在一些疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中也扮演了重要的角色。例如,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程中以及多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)病過程中,鈣粘蛋白均與其關(guān)系密切。因此,開展對鈣粘蛋白的相關(guān)研究亦具有非常重要的現(xiàn)實意義。 鈣粘蛋白是一類存在于細胞粘膜表面介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間相互粘附作用的跨膜糖蛋白,在細胞連接中發(fā)揮重要作用,對于胚胎發(fā)育的細胞識別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。鈣粘蛋白超家族包括經(jīng)典鈣粘蛋白(Classic cadherin),原鈣粘蛋白(Protocadherin, Pcdh),橋粒芯糖蛋白(Desmogleins),橋粒芯膠粘蛋白(Desmocollins)等亞家族,它們在結(jié)構(gòu)方面共享了“鈣粘蛋白重復(fù)”的胞外鈣離子-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在鈣粘蛋白超家族中,原鈣粘蛋白(Pcdh)是最大的亞家族,它的存在決定了細胞之間相互作用的多樣性。原鈣粘蛋白在胞外區(qū)有6-7個串聯(lián)重復(fù)單位,一個一次性跨膜區(qū),胞內(nèi)區(qū)與經(jīng)典鈣粘蛋白和其它鈣粘蛋白有一定的相似性。原鈣粘蛋白由58個成簇型和13個非簇型的亞型組成,其中簇型原鈣粘蛋白根據(jù)其胞質(zhì)區(qū)的不同,被分成三個基因族簇,分別為Pcdh-α,p和丫,而非簇型原鈣粘蛋白根據(jù)其胞外串聯(lián)重復(fù)單位(EC)的數(shù)量和胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)特性分為δ型原鈣粘蛋白和其它原鈣粘蛋白,其中,δ型原鈣粘蛋白根據(jù)是否具有蛋白磷酸酶結(jié)合位點(PPla)又被分為δ1型和δ2型,δ1型含PP1α結(jié)合位點,δ2型不含PPla結(jié)合位點。 Pcdh11屬于Pcdh δ家族中的δ1型,主要表達于腦內(nèi),由7個胞外EC結(jié)構(gòu)、1個短的跨膜結(jié)構(gòu)和一個亞型之間長度可變的胞內(nèi)段組成。Pcdh11分為pcdh11x和pcdh11y兩個亞型,分別位于Xq21.3和Yp11.2染色體上。600萬年前,染色體Xq21.3通過基因轉(zhuǎn)位至Yp11.2,形成了Protocadherin11X/Y基因?qū)?因此,雌性表達Pcdh11x,雄性表達Pcdh11x和pcdh11y。 Pcdh11x的分子結(jié)構(gòu)研究已然較為透徹,然而對其生理作用的研究仍處于起步階段。原鈣粘蛋白與經(jīng)典鈣粘蛋白有一很大不同,即原鈣粘蛋白不僅可介導(dǎo)胞間連接,還可調(diào)控其他分子。當(dāng)其胞內(nèi)段被移除或被其他小分子所取代時,其本身所具有的調(diào)控作用可增強或削弱,表明了原鈣粘蛋白分子作用的多樣性。已有研究報道指出Pcdh11x與精神分裂癥,孤獨癥,躁郁癥或注意力缺失有關(guān),另有一單獨案例發(fā)現(xiàn)語言缺失與Pcdh11x染色體的某一位點缺失相關(guān)。根據(jù)上述案例可知Pcdh11x可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間存在緊密的聯(lián)系。 綜上所述,Pcdh11x主要表達于神經(jīng)系統(tǒng),并發(fā)揮重要作用,與神經(jīng)和精神疾病的發(fā)生密切相關(guān),本課題擬從Pcdh11x在腦內(nèi)的表達分布,對神經(jīng)干細胞增殖、分化和遷移的影響等多個方面入手,研究Pcdh11x在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。 本研究內(nèi)容分為兩章闡述： 第一章Pcdh11x的腦內(nèi)分布及表達情況分析 研究目的 1.研究Pcdh11x在小鼠腦內(nèi)的分布； 2.研究Pcdh11x的細胞定位； 3.神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中Pcdh11x的表達情況； 技術(shù)方法 1.Pcdhllx在小鼠腦內(nèi)表達情況研究 利用免疫組化檢測成年小鼠腦內(nèi)Pcdh11x的表達情況,同時利用Pcdh11x的抗體阻斷肽檢測該抗體的特異性； 利用PCR的方法檢測Pcdh11x mRNA在小鼠體內(nèi)的分布表達情況。 2. Pcdh11x在小鼠體內(nèi)的細胞定位研究 利用免疫熒光染色的方法檢測Pcdh11x與GFAP和Pcdh11x與NeuN的共標(biāo)情況； 利用瞬時轉(zhuǎn)染pCAG-pcdh11x-GFP和pCAG-GFP質(zhì)粒至293T細胞系的方法,同時結(jié)合Pcdh11x的免疫熒光檢測方法,再次確定Pcdh11x抗體的特異性。 3.不同發(fā)育時間點Pcdh11x的表達情況研究 利用熒光定量PCR的方法檢測小鼠胚胎期12天,14天,16天,18天和生后1天,4天和7天不同時間點Pcdh11x在皮層,海馬和側(cè)腦室的表達情況。 4. Pcdh11x與神經(jīng)干細胞相互關(guān)系的研究 利用免疫熒光檢測的手段,檢測Pcdh11x與Nestin和Pcdh11x與Sox-2的共標(biāo)情況； 利用PCR的方法檢測神經(jīng)干細胞中Pcdh11x與Nestin和Sox-2的檢測情況。 5.統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均代表三次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用單向方差分析(One-Way ANOVA)等統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(x±SD)表示。P0.050代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果 1. Pcdhllx主要表達于小鼠腦內(nèi) 我們首次用免疫組化的方法對小鼠成年腦內(nèi)Pcdh11x的分布做了研究,結(jié)果表明Pcdh11x主要分布于皮層,下丘腦,紋狀體等腦區(qū)。同時為了驗證Pcdh11x抗體的特異性,我們加入了針對Pcdh11x抗體的阻斷肽以阻斷Pcdh11x抗體的結(jié)合位點,結(jié)果表明該組并未檢測到Pcdh11x的陽性信號。 在本研究中,我們?yōu)榱藱z測Pcdh11x在小鼠體內(nèi)的表達分布情況,還對其mRNA用RT-PCR的方法進行了檢測。首先,我們對Pcdh11x在側(cè)腦室,海馬,皮層,腎臟,肝臟,心臟等器官組織的分布進行了檢測,結(jié)果表明,Pcdh11x主要表達于小鼠腦內(nèi),在其他組織僅有較少量的分布。接下來,我們對小鼠腦內(nèi)不同腦區(qū)內(nèi)Pcdh11x的表達情況進行了分析。我們的結(jié)果表明Pcdh11x在中腦,皮層,海馬,側(cè)腦室,小腦,下丘腦,胼胝體和黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)均有表達。 2. Pcdh11x主要定位于NeuN+細胞,不表達于GFAP+細胞 上述Pcdh11x的表達情況提示Pcdh11x主要分布于腦內(nèi),接下來我們對Pcdh11x的細胞定位進行了一系列研究。為此,我們對Pcdh11x和GFAP及Pcdh11x和NeuN分別進行了共標(biāo)。通過將Pcdh11x和GFAP共標(biāo),進行免疫熒光檢測,結(jié)果顯示GFAP主要表達于胼胝體和皮層邊緣區(qū),側(cè)腦室邊緣區(qū),而Pcdh11x主要表達于皮層,兩者表達于完全不同的腦區(qū),未發(fā)現(xiàn)在同一細胞共標(biāo)的現(xiàn)象。而將Pcdh11x和NeuN共標(biāo)進行免疫熒光檢測,我們發(fā)現(xiàn)Pcdh11x完全表達于NeuN+的細胞。以上結(jié)果表明Pcdh11x主要定位于NeuN+細胞,不表達于GFAP+細胞。為了對結(jié)果進行驗證,我們用pCAG-pcdh11x-GFP和pCAG-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,再進行Pcdh11x的免疫熒光染色,結(jié)果顯示pCAG-pcdh11x-GFP組GFP可與Pcdh11x完全重疊,而向293T細胞轉(zhuǎn)染pCAG-GFP質(zhì)粒后,Pcdh11x的免疫熒光染色結(jié)果則顯示并未檢測到Pcdh11x信號。這一結(jié)果表明Pcdh11x的抗體具有較強的特異性。結(jié)合前面抗體阻斷肽的的結(jié)果,可以認為上述的免疫組化及免疫熒光結(jié)果可靠,可作為下步實驗的參考依據(jù)。 3.小鼠腦內(nèi)不同發(fā)育時間點Pcdh11x的表達情況 為了進一步研究Pcdh11x在小鼠腦發(fā)育過程中所起的作用,我們用熒光定量PCR的方法對Pcdh11x在小鼠胚胎期12天,14天,16天,生后1天,4天和7天在皮層,海馬和側(cè)腦室的表達情況進行了分析。 在胚胎期12天,14天,16天,18天,生后1天,4天和7天對大腦皮層的Pcdh11x mRNA進行分析,胚胎期14天,16天,18天,生后1天,4天和7天各不同發(fā)育時間點之間Pcdh11x的表達有統(tǒng)計學(xué)差異(F=53.209,P=0.000),分別與胚胎期12天Pcdh11x的表達相比,Pcdh11x在胚胎期14天(1.000±0.000vs.0.052±0.025；P0.050),胚胎期16天(1.000±0.000vs.0.395±0.184；P0.050),胚胎期18天(1.000±0.000vs.0.391±0.021；P0.050)和生后1天(1.000±0.000vs.0.296±0.028；P0.050)均有統(tǒng)計學(xué)差異,從結(jié)果來看表達較弱。 在胚胎期14天,16天,生后1天,4天和7天對大腦海馬區(qū)的Pcdh11x mRNA進行分析,胚胎期16天,18天,生后1天,4天和7天各不同發(fā)育時間點Pcdh11x的表達有統(tǒng)計學(xué)差異(F=31.393,P=0.002),分別與胚胎期14天相比,Pcdh11x在胚胎期16天(1.000±0.000vs.0.221±0.212；P0.050),胚胎期18天(1.000±0.000vs.0.257±0.089; P0.050),生后1天(1.000±0.000vs.1.844±0.202; P0.050),生后7天(1.000±0.000vs.0.556±0.039; P0.050)的表達均有統(tǒng)計學(xué)差異,從結(jié)果來看胚胎期16天,胚胎期18天,生后7天表達較弱,而生后1天Pcdh11x的表達量較高。 在胚胎期12天,14天,16天,18天,生后1天,4天和7天對大腦側(cè)腦室區(qū)和腦室下區(qū)的Pcdh11x mRNA進行分析,胚胎期14天,16天,18天,生后1天,4天和7天各不同發(fā)育時間點之間Pcdhllx的表達有統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.279,P=0.018),與胚胎期12天相比,生后1天(1.000±0.000vs.6.964±1.171；P0.050)、生后7天(1.000±0.000vs.10.181±2.463; P0.050) Pcdh11x的表達有統(tǒng)計學(xué)差異,生后1天和生后7天Pcdh11x表達較強,而Pcdh11x的表達在其他各時間點的表達與胚胎期12天相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.050)。綜上所述,Pcdh11x mRNA的表達是動態(tài)變化的,可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。 4. Pcdh11x主要表達于神經(jīng)干細胞 從上述的研究我們得知,Pcdh11x在腦內(nèi)分布廣泛,并在胚胎發(fā)育過程中動態(tài)表達,可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,那么Pcdh11x與在神經(jīng)發(fā)育過程中具有自我更新、多向分化潛能的神經(jīng)干細胞之間有什么關(guān)聯(lián)成為我們接下來的研究目標(biāo)。我們用Pcdh11x與Nestin雙標(biāo)或Pcdh11x與Sox-2進行免疫熒光檢測。通過對體外神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和胚胎期16天的腦組織進行Pcdh11x與Nestin雙標(biāo),我們發(fā)現(xiàn)Pcdh11x與Nestin共表達。通過對體外神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和胚胎期14天的腦組織進行Pcdh11x與Sox-2的雙標(biāo),我們發(fā)現(xiàn)Pcdh11x同樣可以與Sox-2共標(biāo)。同時,為了進一步驗證神經(jīng)干細胞中Pcdh11x與Nestin和Sox-2的表達情況,我們利用了PCR的方法對其mRNA進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞中可同時表達Pcdh11x及Nestin和Sox-2的mRNA.綜上所述,Pcdh11x廣泛表達于小鼠腦內(nèi),并在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用,同時可能是神經(jīng)干細胞發(fā)揮自我更新及多向分化潛能的重要分子基礎(chǔ)。 結(jié)論 1. Pcdh11x屬于原鈣粘蛋白超家族,主要表達于小鼠腦內(nèi),并在不同腦區(qū)均有分布,免疫組化結(jié)果顯示Pcdh11x主要表達于皮層與下丘腦腦區(qū)； 2. Pcdh11x的細胞定位主要為NeuN+神經(jīng)元,并不表達于GFAP+細胞； 3. Pcdh11x在小鼠胚胎發(fā)育期主要定位于Nestin+/Sox-2+的神經(jīng)干細胞,參與小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。 第二章Pcdh11x調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖、分化和遷移 研究目的 研究Pcdh11x對神經(jīng)干細胞增殖、分化和遷移的影響。 技術(shù)方法 1.研究Pcdh11x對神經(jīng)干細胞增殖、分化和遷移的影響 利用體內(nèi)、體外RNA干擾手段,檢測轉(zhuǎn)染抑制表達(pcdh11x-shRNA)和過表達Pcdh11x (pCAG-pcdh11x-GFP)質(zhì)粒后對神經(jīng)干細胞增殖(BrdU, Ki67)的影響； 利用體外轉(zhuǎn)染抑制表達(pcdh11x-shRNA, pcdh11x-siRNA)和過表達Pcdhllx(pCAG-pcdh11x-GFP)質(zhì)粒的手段,檢測Pcdhllx對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化(Tuj-1)的影響； 利用子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的手段在體轉(zhuǎn)染pcdh11x-shRNA抑制表達質(zhì)�；騪CAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒,檢測Pcdhllx對神經(jīng)干細胞分化(Ctip2, Tbrl, Tbr2, Pax-6)的影響以及對細胞遷移(GFP+細胞)的影響； 利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染nc-shRNA, pcdh11x-shRNA, pCAG-GFP和pCAG-pcdh11x-GFP對神經(jīng)干細胞凋亡的影響。 2.統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均代表三次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用單向方差分析(One-Way ANOVA)及獨立樣本t檢驗(independent sample T test)等統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(；±SD)表示。P0.050為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果 1.Pcdh11x可促進神經(jīng)干細胞的增殖 通過向培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分別轉(zhuǎn)染nc-siRNA對照質(zhì)粒和pcdh11x-siRNA干擾質(zhì)粒,48h后,我們對其進行BrdU標(biāo)記,孵育2h后,進行免疫熒光染色觀察,結(jié)果顯示抑制表達Pcdh11x后,與nc-siRNA對照質(zhì)粒相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.913,P=0.000), pcdh11x-siRNA干擾質(zhì)粒組與對照組相比BrdU陽性率顯著下降(11.383±4.497vs.4.055±2.189),表明抑制表達Pcdh11x可明顯抑制神經(jīng)干細胞的增殖。通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法,我們將pcdh11x-shRNA的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染胚胎期14天胎腦,3天后,切片觀察Ki67的表達情況,結(jié)果顯示對照質(zhì)粒組與pcdh11x-shRNA質(zhì)粒組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.052,P=0.000),與對照質(zhì)粒組相比,Ki67陽性率在pcdh11x-shRNA質(zhì)粒組顯著下降(19.230±1.815vs.12.661±4.070),可在體明顯抑制Ki67的表達,再次表明抑制表達Pcdh11x可明顯抑制神經(jīng)干細胞的增殖。 通過向培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分別轉(zhuǎn)染pCAG-GFP對照質(zhì)粒和pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒,48h后,我們對其進行BrdU標(biāo)記,孵育2h后,進行免疫熒光染色觀察,結(jié)果顯示兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.889,P=0.000),與pCAG-GFP對照質(zhì)粒組相比,pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒組BrdU陽性率顯著升高(7.893±3.359vs.19.413±3.216),表明過表達Pcdh11x可明顯促進神經(jīng)干細胞的增殖。通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法,我們將pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒和對照質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染胚胎期14天胎腦,3天后,切片觀察Ki67的表達情況,結(jié)果顯示各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.052,P=0.000),pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒組可在體明顯促進Ki67的表達(19.230±1.815vs.24.092±1.024),再次表明過表達Pcdh11x可明顯促進神經(jīng)干細胞的增殖。 2. Pcdh11x可抑制神經(jīng)干細胞的分化 通過向培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分別轉(zhuǎn)染nc-siRNA對照質(zhì)粒和pcdh11x-siRNA干擾質(zhì)粒,5-7天后,我們對其進行免疫熒光染色觀察,結(jié)果顯示兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.618,P=0.000),pcdh11x-siRNA干擾質(zhì)粒組可使Tuj-1陽性細胞的比例顯著升高(15.028±6.212vs.23.996±9.895)。同樣,我們根據(jù)nc-siRNA對照質(zhì)粒和pcdh11x-siRNA干擾質(zhì)粒序列設(shè)計合成了更加穩(wěn)定的nc-shRNA和pcdh11x-shRNA,結(jié)果顯示nc-shRNA組和pcdh11x-shRNA組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.766,P=0.011),pcdh11x-shRNA組可使Tuj-1陽性細胞的比例顯著升高(26.393±1.9035vs.49.814±22.920),表明抑制表達Pcdh11x可明顯促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法,我們將pcdh11x-shRNA的質(zhì)粒和對照質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染胚胎期14天胎腦,3天后,切片觀察皮層分化神經(jīng)干細胞不同標(biāo)志物(包括Ctip2, Tbrl, Tbr2, Pax6)的表達情況,結(jié)果顯示各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Ctip2+:t=-5.784, P=0.000; Tbrl+:t=-8.899, P=0.000; Tbr2+:t=-4.060, P=0.001; Pax6+:t=12.442, P=0.000),抑制表達Pcdhllx后可明顯促進Ctip2+大腦皮層V層和VⅥ層神經(jīng)元(0.056±0.006vs.0.112±0.027), Tbrl+大腦皮層VⅥ層神經(jīng)元(0.142±0.021vs.0.241±0.023)和Tbr2+基底祖細胞(Basal Progenitors)的表達(0.049±0.031vs.0.097±0.013),相反,對Pax6+放射狀膠質(zhì)細胞／頂端祖細胞(Radial Glia/Apical Progenitors)的表達有明顯的抑制作用(0.139±0.008vs.0.080±0.011),表明抑制表達Pcdhllx可明顯促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。 通過向培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞分別轉(zhuǎn)染pCAG-GFP對照質(zhì)粒和pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒,5-7天后,我們對其進行免疫熒光染色觀察,結(jié)果顯示兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.083,P=0.000),過表達Pcdhllx后,可使Tuj-1陽性細胞的比例顯著性下降(25.462±6.235vs.13.074±3.737)。表明過表達Pcdhllx可明顯抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法,我們將pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染胚胎期14天的胎腦,3天后,切片觀察皮層分化神經(jīng)干細胞不同標(biāo)志物(包括Ctip2, Tbr1, Tbr2, Pax6)的表達情況,結(jié)果顯示各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Ctip2+:t=15.137,P=0.000; Tbrl+:t=8.898, P=0.000; Tbr2+:t=9.767, P=0.000; Pax6+:t=-10.122, P=0.000)過表達Pcdhllx后可明顯抑制Ctip2+大腦皮層V層和VⅥ層神經(jīng)元(0.072±0.009vs.0.018±0.004),Tbr1+大腦皮層VⅥ層神經(jīng)元(0.122±0.013vs.0.066±0.012)和Tbr2+基底祖細胞(Basal Progenitors)的表達(0.075±0.012vs.0.021±0.010),相反,對Pax6+放射狀膠質(zhì)細胞／頂端祖細胞(Radial Glia/Apical Progenitors)的表達有明顯的促進作用(0.123±0.013vs.0.192±0.015),表明過表達Pcdhllx可明顯抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。 3. Pcdhllx抑制神經(jīng)干細胞向皮層遠端的遷移 通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法,我們將nc-shRNA對照質(zhì)粒,pcdh11x-shRNA抑制表達質(zhì)粒和pCAG-pcdh11x-GFP過表達質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染胚胎期14天的胎腦,3天后,切片觀察GFP陽性細胞的遷移情況。結(jié)果顯示在CP區(qū),IZ區(qū)和SVZ/VZ區(qū)各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(CP:F=29.362, P=0.004; IZ:F=4.496, P=0.044; SVZ/VZ:F=35.387, P=0.002),抑制表達Pcdhllx可明顯促進GFP+細胞離開側(cè)腦室／腦室下區(qū)遷移到皮層板區(qū)(CP:0.124±0.035vs.0.167±0.054; IZ:0.541±0.057vs.0.599±0.054; SVZ/VZ:0.335±0.025vs.0.234±0.010),而過表達Pcdhllx則抑制GFP+細胞離開側(cè)腦室／腦室下區(qū)遷移向皮層板區(qū)的遷移(CP:0.124±0.035vs.0.015±0.005; IZ:0.54±0.057vs.0.498±0.022; SVZ/VZ:0.335±0.025vs.0.425±0.068)。 4.抑制表達或過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對神經(jīng)干細胞凋亡的影響 本課題多次轉(zhuǎn)染抑制表達或過表達的質(zhì)粒,質(zhì)粒本身對細胞的毒性作用如何,是否對我們的實驗結(jié)果造成大的影響,以及是否通過影響細胞的凋亡進而影響細胞的增殖和分化,這將直接影響本課題數(shù)據(jù)及結(jié)論的可靠性,為此,我們對各組進行了檢測。我們利用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒對各組進行檢測,結(jié)果顯示nc-shRNA組,抑制表達Pcdhllx組,pCAG-GFP組和過表達Pcdhllx組,與陰性對照組相比凋亡細胞均有所增加,然而nc-shRNA組,抑制表達Pcdhllx組,pCAG-GFP組和過表達Pcdhllx組之間的凋亡情況并無明顯改變。說明四組轉(zhuǎn)染后對細胞的毒性是一致的,也沒有通過影響細胞的凋亡進而影響細胞的增殖和分化,對本課題的結(jié)論并未造成大的影響。 結(jié)論 1.體外實驗結(jié)果表明抑制表達Pcdhllx能夠促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化,同樣體外過表達Pcdhllx可抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化； 2.在體實驗結(jié)果表明抑制表達Pcdhllx,可明顯促進Ctip2+大腦皮層V層和Ⅵ層神經(jīng)元,Tbrl+大腦皮層Ⅵ層神經(jīng)元和Tbr2+基底祖細胞的表達,相反,對Pax6+放射狀膠質(zhì)細胞/頂端祖細胞的表達有明顯的抑制作用； 3.同理,在體實驗結(jié)果表明過表達Pcdhllx,可明顯抑制Ctip2+大腦皮層V層和Ⅵ層神經(jīng)元,Tbrl+大腦皮層Ⅵ層神經(jīng)元和Tbr2+基底祖細胞的表達,相反,對Pax6+放射狀膠質(zhì)細胞/頂端祖細胞的表達有明顯的促進作用； 4.本課題的體內(nèi)、體外實驗結(jié)果均表明過表達Pcdhllx,可明顯促進神經(jīng)干細胞的增殖；在體抑制表達Pcdhllx,可明顯抑制神經(jīng)干細胞的增殖； 5.在體實驗表明抑制表達Pcdhllx可明顯促進GFP+細胞離開側(cè)腦室/腦室下區(qū)遷移到皮層板區(qū),而過表達Pcdhllx則抑制GFP+細胞離開側(cè)腦室/腦室下區(qū)遷移向皮層板區(qū)的遷移。 綜上所述,我們的研究表明Pcdhllx在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,可促進神經(jīng)干細胞的增殖,并對其分化有明顯的抑制作用；我們的在體實驗也進一步證實了體外結(jié)果,表明Pcdhllx抑制神經(jīng)干細胞退出細胞周期,向皮層遠端遷移,促進神經(jīng)干細胞的自我更新。這一研究成果為深入理解原鈣粘蛋白在神經(jīng)細胞中的作用提供了實驗參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741

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4 王念;絞股藍皂苷對脊髓源神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)的影響[D];陜西師范大學(xué);2011年

5 劉朋;海藻酸鈣/明膠微膠珠的制備及在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用[D];大連理工大學(xué);2011年

6 郭兵;大鼠羊膜上皮細胞體外向類神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化及其移植后對視神經(jīng)再生的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

7 吳琿;神經(jīng)干細胞玻璃化凍存及其生物學(xué)特性的研究[D];大連理工大學(xué);2011年

8 王培福;大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和鑒定[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2002年

9 劉孟宇;膠質(zhì)瘤細胞條件培養(yǎng)基對神經(jīng)干細胞遷移的影響[D];蘇州大學(xué);2010年

10 朱愛萍;重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對帕金森病模型小鼠體內(nèi)神經(jīng)干細胞增殖的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號：1623948