本文選題：蛙皮素　切入點(diǎn)：癲癇　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：癲癇（Epilepsy）近十年來(lái)發(fā)病率逐年增加，據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年底統(tǒng)計(jì)，全球患者約5000萬(wàn)，現(xiàn)已成為僅次于腦血管病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾患。最新流行病學(xué)研究表明，癲癇的全世界平均發(fā)病率高達(dá)0.7%，這其中有近30%的患者無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)藥物或其他治療手段使病情得以控制，有近一半癲癇患者的平均壽命僅為55歲，他們?cè)谏尜|(zhì)量明顯下降的同時(shí)也給家庭和社會(huì)增加了大量的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而以上情勢(shì)在以我國(guó)為代表的發(fā)展中國(guó)家顯得更為突出和嚴(yán)峻。盡管世界各國(guó)針對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制和治療手段進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，但迄今為止對(duì)其具體發(fā)生機(jī)理仍然不清楚，經(jīng)典的抗癲癇藥物治療又往往帶來(lái)耐藥性和毒副作用等問(wèn)題，因此從疾病機(jī)制研究入手，尋找更為安全、有效的治療手段就顯得尤為重要。蛙皮素（Bombesin）是一種含14個(gè)氨基酸殘基的生物活性多肽。研究發(fā)現(xiàn)它作為一種腦腸肽在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，并且通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、腦缺血再灌注損傷以及學(xué)習(xí)記憶功能形成中均發(fā)揮了重要作用。新近研究表明，在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病帕金森�。≒arkinson's disease）和老年癡呆癥（Alzheimer'sdisease）發(fā)病過(guò)程中Bombesin表達(dá)量均明顯改變；同時(shí)，作為海馬神經(jīng)纖維最為重要的投射區(qū)域，內(nèi)嗅皮層（Entorhinal cortex）在情緒和神經(jīng)系統(tǒng)興奮性調(diào)節(jié)方面亦扮演著極為重要的角色。本研究旨在觀察Bombesin可以促進(jìn)GABA能中間神經(jīng)元遞質(zhì)釋放，進(jìn)一步闡明Bombesin調(diào)節(jié)內(nèi)嗅皮層抑制性神經(jīng)元興奮性和調(diào)節(jié)遞質(zhì)突觸傳遞的機(jī)制，最終證實(shí)Bombesin通過(guò)增加內(nèi)嗅皮層抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而減少神經(jīng)元異常興奮，并可作為內(nèi)源性多肽物質(zhì)抑制癲癇發(fā)生，為癲癇機(jī)制研究和臨床抗癲癇藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)一：蛙皮素對(duì)內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）的影響 目的：觀察給予Bombesin后內(nèi)嗅皮層Stellate和Pyramidal神經(jīng)元自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）的變化情況。 方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠離體腦片，采用全細(xì)胞電壓鉗分別記錄給予Bombesin后內(nèi)嗅皮層區(qū)域II層兩種主要神經(jīng)元Stellate和Pyramidal自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）的頻率及振幅變化情況；（2）觀察不同濃度（0.01/0.05/0.075/0.1/0.25/0.5μM）Bombesin對(duì)Stellate神經(jīng)元sIPSCs變化產(chǎn)生的劑量效應(yīng)關(guān)系；（3）觀察給予Bombesin兩種受體拮抗劑后Stellate神經(jīng)元sIPSCs變化情況；（4）觀察給予Bombesin的兩種相似肽NMB/GRP對(duì)于Stellate神經(jīng)元sIPSCs的影響。 結(jié)果：（1）給予0.25μM Bombesin后明顯增加了Stellate和Pyramidal自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）的頻率（Stellate:204±26%of Control, P=0.01/Pyramidal:196±15%of Control, P=0.002，n=10）及振幅（128±6%of Control, P=0.006/Pyramidal:126±6%ofControl, P=0.003，n=10）；（2）通過(guò)外源性給予七種不同梯度劑量Bombesin后計(jì)算出劑量效應(yīng)關(guān)系曲線，得出EC50=42nM；（3）給予BB1/BB2非選擇性受體拮抗劑PD176252（10μM）后可以明顯抑制Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（136±12%of Control, P=0.034，n=10）和振幅（122±13%of Control, P=0.19，n=10）增加，給予選擇性BB2受體拮抗劑(D-Phe6, Leu-NHEt13, des-Met14)-Bomsesin(6-14)（6μM）后沒(méi)有抑制Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（180±21%ofControl, P=0.43，n=10）和振幅（129±8%of Control, P=0.98，n=10）增加，（4）給予選擇性BB1受體激動(dòng)劑相似肽NMB（0.25μM）可以模擬出Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（188±26%of Control, P=0.027，n=6）和振幅（152±16%of Control,P=0.036，n=10）的明顯增加，給予選擇性BB2受體激動(dòng)劑相似肽GRP（0.25μM）同樣可以模擬出Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（190±24%of Control,P=0.02，n=10）和振幅（129±4%of Control, P=0.004，n=10）的明顯增加。 實(shí)驗(yàn)二：蛙皮素對(duì)內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元微小抑制性突觸后電流（mIPSCs）和誘發(fā)抑制性突觸后電流（eIPSCs）的影響 目的：研究Bombesin促進(jìn)神經(jīng)元GABA釋放的突觸作用機(jī)制。 方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠離體腦片，，采用全細(xì)胞電壓鉗阻斷動(dòng)作電位后給予Bombesin記錄內(nèi)嗅皮層區(qū)域Stellate神經(jīng)元微小抑制性突觸后電流（mIPSCs）的頻率及振幅變化情況；（2）去除細(xì)胞外液Ca2+或使用電壓門(mén)控Ca2+通道阻斷劑Cd2+/Ni2+（100μM）后給予Bombesin觀察sIPSCs的變化情況；（3）使用刺激電極對(duì)內(nèi)嗅皮層區(qū)域進(jìn)行刺激，觀察給予Bombesin后eIPSCs的變化情況；（4）給予Bombesin的同時(shí)使用刺激電極對(duì)內(nèi)嗅皮層區(qū)域進(jìn)行成對(duì)刺激（50ms,0.1Hz）并記錄eIPSCs，觀察PPR的變化情況。 結(jié)果：（1）阻斷動(dòng)作電位后，給予Bombesin后Stellate神經(jīng)元mIPSCs頻率（109±5%of Control, P=0.12，n=10）和振幅（96±2%of Control, P=0.14，n=10）沒(méi)有明顯變化；（2）使用無(wú)Ca2+細(xì)胞外液灌流后可以明顯抑制Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（117±14%of Control, P=0.27，n=10）和振幅增加（95±3%of Control,P=0.12，n=10）；正常人工腦脊液加入電壓門(mén)控Ca2+通道阻斷劑Cd2+/Ni2+后灌流可以明顯抑制Bombesin所誘導(dǎo)的Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率（133±34%of Control, P=0.56，n=10）和振幅增加（96±2%of Control, P=0.07，n=10）；（3）給予Bombesin并使用刺激電極后發(fā)現(xiàn)其可以明顯降低第一刺激eIPSCs振幅（85±5%of Control, P=0.04，n=5）；（4）給予Bombesin并使用刺激電極后記錄eIPSCs并對(duì)成對(duì)刺激進(jìn)行PPR計(jì)算，其可以明顯增加PPR值。 實(shí)驗(yàn)三：蛙皮素促使內(nèi)嗅皮層GABA能中間神經(jīng)元去極化及其機(jī)制研究 目的：研究Bombesin促進(jìn)內(nèi)嗅皮層GABA能中間神經(jīng)元遞質(zhì)釋放的機(jī)制。 方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠離體腦片，使用全細(xì)胞電流鉗鑒定內(nèi)嗅皮層III層GABA中間神經(jīng)元種類(lèi)，并且給予Bombesin后觀察膜靜息電位（RMPs）和輸入電阻（Input Resistance,-50pA,500ms）的變化情況；（2）使用電流鉗觀察給予Bombesin后中間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏淖兓闆r；（3）使用電壓鉗，鉗制電壓保持-60mV，觀察給予Bombesin后中間神經(jīng)元鉗制電流的變化情況；（4）使用Na+/Ca2+阻斷劑后給予Bombesin，觀察中間神經(jīng)元膜電位變化情況；（5）灌流（μM）100Cd2+/0.5TTX/100Ni2+/10DNQX/50APV/10Bicuculline后給予Bombesin，記錄Ramp電壓-電流曲線（-120~-60mV,0.1mV/ms）；（6）給予Bombesin的同時(shí)使用內(nèi)向整流鉀離子通道（inward rectifier K+channels, Kirs）阻斷劑Ba2+（0.5mM）觀察中間神經(jīng)元膜電位以及內(nèi)嗅皮層II層Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率變化情況。 結(jié)果：（1）確認(rèn)所記錄神經(jīng)元為GABA能I/II型中間神經(jīng)元，給予Bombesin發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元膜電位發(fā)生明顯去極化現(xiàn)象（Control:-63.7±0.8mV, BB:-61.6±0.9mV, n=8,P=0.001），同時(shí)輸入電阻也明顯增加（Control:315±36M, BB:362±46M, n=8,P=0.026）；（2）給予Bombesin后觀察到中間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率明顯增加（416±54%of Control, n=6, P=0.001）的同時(shí)振幅略有減�。�92±1%of Control, n=6, P=0.001）；（3）將神經(jīng)元鉗制在-60mV后給予Bombesin，發(fā)現(xiàn)鉗制電流發(fā)生明顯增加（-8.7±1.4pA,n=6, P=0.001）；（4）使用Na+阻斷劑NMDG-Cl無(wú)法抑制Bombesin所誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元膜電位去極化的發(fā)生（2.5±0.3mV, n=7, P=0.001），使用EGTA-0Ca2+細(xì)胞外液灌流后無(wú)法抑制Bombesin所誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元膜電位去極化的發(fā)生（3.2±1.6mV,n=7, P=0.7）；（5）灌流（μM）100Cd2+/0.5TTX/100Ni2+/10DNQX/50APV/10Bicuculline后給予Bombesin記錄Ramp電壓-電流曲線，發(fā)現(xiàn)其反轉(zhuǎn)電位為-85.6mV，接近于K+電位；（6）給予Bombesin的同時(shí)使用內(nèi)向整流鉀離子通道（inward rectifierK+channels, Kirs）阻斷劑Ba2+（0.5mM），發(fā)現(xiàn)中間神經(jīng)元膜電位沒(méi)有明顯變化（0.5±0.4mV, n=7, P=0.25），同時(shí)內(nèi)嗅皮層II層Stellate神經(jīng)元sIPSCs頻率也沒(méi)有發(fā)生明顯改變（228±45%of Control, n=8, P=0.026）。 實(shí)驗(yàn)四：蛙皮素和其相似肽在無(wú)Mg2+誘導(dǎo)的內(nèi)嗅皮層癲癇樣活動(dòng)中的作用研究 目的：觀察Bomsesin和其相似肽對(duì)于癲癇活動(dòng)的抑制作用。 方法：使用15~20天雄性SD大鼠離體腦片，正常溫育結(jié)束后使用無(wú)Mg2+人工腦脊液繼續(xù)孵育1~3小時(shí)，隨后持續(xù)無(wú)Mg2+細(xì)胞外液灌流并使用場(chǎng)電位記錄癲癇活動(dòng)15分鐘，隨后分別給予Bombsin或其相似肽NMB/GRP（0.25μM）15分鐘，停藥后繼續(xù)洗脫記錄30分鐘，記錄并比較全程癲癇樣活動(dòng)的變化情況。 結(jié)果：無(wú)Mg2+細(xì)胞外液灌流誘發(fā)腦片癲癇樣活動(dòng)成功，給予Bombesin（0.25μM）后可以明顯抑制內(nèi)嗅皮層區(qū)域癲癇樣活動(dòng)（Control:4.38±1.12events/min, BB:1.07±0.43events/min, n=6）,給予NMB（0.25μM）后同樣可以明顯抑制內(nèi)嗅皮層區(qū)域癲癇樣活動(dòng)（Control:10.30±1.29events/min, NMB:2.04±0.88events/min, n=6），給予GRP（0.25μM）后亦可以明顯抑制內(nèi)嗅皮層區(qū)域癲癇樣活動(dòng)（Control:5.93±1.67events/min, GRP:0.93±0.35events/min, n=6）。 結(jié)論 1．蛙皮素通過(guò)作用于BB1/BB2受體增加神經(jīng)元突觸前GABA釋放，但對(duì)突觸后GABA受體數(shù)量沒(méi)有影響。 2．蛙皮素通過(guò)抑制Kris引起GABA能中間神經(jīng)元去極化，并通過(guò)動(dòng)作電位頻率增加激活電壓依賴(lài)型鈣通道，最終增加GABA釋放。 3．蛙皮素和其相似肽所引起的GABA釋放增加的易化作用可以明顯抑制神經(jīng)元的癲癇活動(dòng)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 任今鵬,夏卉莉,程介士;實(shí)驗(yàn)性癲癇時(shí)海馬內(nèi)一氧化氮合酶的變化及其與谷氨酸受體的關(guān)系[J];生理學(xué)報(bào);1998年04期

2 王紅,蔡浩然;細(xì)胞外Ca~(2+)對(duì)爪蟾腦片神經(jīng)元微抑制性突觸后電流的調(diào)制[J];生理學(xué)報(bào);2003年05期

本文編號(hào)：1616984