本文選題：腦缺血　切入點(diǎn)：小膠質(zhì)細(xì)胞　出處：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:缺血性腦卒中是一種致殘及致死性均高的疾病。腦缺血所致的損傷不僅來(lái)自急性期缺血導(dǎo)致的腦損傷,也來(lái)自于后期繼發(fā)的炎癥反應(yīng)造成的腦損傷。目前急性腦缺血的治療藥物僅有溶栓藥,對(duì)于腦缺血后期的治療手段十分缺乏。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)介導(dǎo)炎癥和免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,其持續(xù)激活介導(dǎo)腦缺血慢性期的炎癥。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有兩種類型,分別稱為經(jīng)典激活(classical activation)的小膠質(zhì)細(xì)胞和選擇性激活(alternative activation)的小膠質(zhì)細(xì)胞,一般認(rèn)為,M1型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種炎癥因子會(huì)對(duì)大腦神經(jīng)功能恢復(fù)將產(chǎn)生有害作用;而M2型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有抗炎作用。因而調(diào)整小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)(極化類型)可能作為抗腦缺血損傷治療的靶點(diǎn)事件。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NicotinamidePhosporibosyltransferase,NAMPT),又被稱作內(nèi)臟脂肪素(visfatin)和前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(Pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF),是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)補(bǔ)救合成途徑的限速酶,NAMPT通過(guò)NAD及NAD依賴的酶(如Sirtuins、PARPs)在細(xì)胞物質(zhì)能量代謝、衰老、炎癥、免疫等過(guò)程中起重要作用。NAMPT在體內(nèi)廣泛存在,并可被外周炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等釋放,而進(jìn)一步參與外周炎癥過(guò)程;NAMPT特異性抑制劑FK866被報(bào)道有明顯的抗炎作用。在中樞,NAMPT主要表達(dá)于神經(jīng)元,膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)NAMPT。因而,有關(guān)NAMPT在中樞炎癥中的作用,如其在腦缺血后的炎癥中的作用報(bào)道很少。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),在老年小鼠腦內(nèi),NAMPT大量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞,而長(zhǎng)期慢性的中樞炎癥是老年腦的主要特征之一;另外,我們還發(fā)現(xiàn),NAMPT在大鼠腦缺血急性期不表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞,但在大鼠腦缺血后期,小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)NAMPT,而星形膠質(zhì)細(xì)胞始終不表達(dá)NAMPT;腦缺血后腦脊液中NAMPT水平升高;我們推測(cè),腦缺血后期小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)NAMPT與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥有關(guān),而腦缺血后腦脊液中高水平的NAMPT除來(lái)自損傷的神經(jīng)元和外周的NAMPT經(jīng)損傷的血腦屏障滲入外,還可能來(lái)自小膠質(zhì)細(xì)胞的釋放,這些釋放的NAMPT也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的缺血慢性期炎癥。因而,本課題關(guān)注以下問(wèn)題:1)小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)的NAMPT是否參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦缺血慢性期的炎癥,其涉及的機(jī)制有哪些?2)在缺血和炎癥條件下,小膠質(zhì)細(xì)胞能否釋放NAMPT?小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMPT的具體出胞機(jī)制是怎樣的?研究目的:探討在整體腦缺血過(guò)程中及離體缺血條件下,小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的NAMPT對(duì)腦缺血慢性期炎癥的調(diào)控及其作用機(jī)制;在缺血和炎癥條件下,小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMPT的出胞途徑及其影響因素。研究方法:第一部分:以NAMPT抑制劑FK866側(cè)腦室注射預(yù)給藥,大鼠局灶性腦缺血再灌注處理(MCAO 1h/R14d)后,以行為學(xué)檢測(cè)反映大鼠神經(jīng)功能損傷/恢復(fù)情況,腦片免疫組化、免疫熒光染色觀察神經(jīng)元存活、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況;以缺糖缺氧再恢復(fù)(OGD1h/R24h)處理原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,用免疫熒光染色觀察原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞NAMPT的表達(dá)情況;以FK866預(yù)處理給藥,原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞OGD1h/R24h處理后,觀察細(xì)胞形態(tài)變化;以不同濃度FK866預(yù)處理給藥后,以O(shè)GD1 h/R 24 h處理小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞,觀察BV2小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化,檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放;以O(shè)GD1 h/再恢復(fù)0-24 h處理BV2細(xì)胞后,檢測(cè)BV2細(xì)胞內(nèi)M1與M2型標(biāo)記物的表達(dá);以FK866預(yù)處理給藥后,以O(shè)GD1 h/R 24 h處理BV2細(xì)胞,檢測(cè)BV2細(xì)胞內(nèi)M1與M2型標(biāo)記物的表達(dá);以O(shè)GD1h/R24h處理BV2細(xì)胞,檢測(cè)胞漿和細(xì)胞核的NF-κB表達(dá)水平;以FK866預(yù)處理,檢測(cè)OGD1 h/R 24 h處理后胞漿和細(xì)胞核NF-κB表達(dá)水平變化;以NF-κB抑制劑做預(yù)處理,在OGD1 h/R24 h處理BV2細(xì)胞后,檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-6和NAMPT的表達(dá)。第二部分:原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞以O(shè)GD 1h/R24h處理后,免疫熒光染色觀察NAMPT細(xì)胞內(nèi)分布和表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞釋放NAMPT,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞處理后培養(yǎng)基上清LDH活性變化,以及PI染色鑒定細(xì)胞壞死;采用體外模擬缺血條件(OGD/R)以及以炎癥條件(TNF-α)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞釋放刺激因子ATP處理BV2細(xì)胞后,以免疫熒光染色聯(lián)合特定標(biāo)記分子確定法,檢測(cè)NAMPT與溶酶體、多種內(nèi)體是否存在共定位;以透射電鏡觀察BV2細(xì)胞的囊泡釋放,并通過(guò)囊泡直徑測(cè)量初步確定BV2細(xì)胞經(jīng)以上處理后釋放大量外泌體;以免疫電鏡觀察BV2初步確定NAMPT通過(guò)外泌體途徑釋放;采用超速離心法或商業(yè)性外泌體提取試劑盒方法收集細(xì)胞上清中的外泌體后,以Western blotting方法檢測(cè)外泌體中NAMPT的量;以磷脂酶D抑制劑預(yù)處理后,以O(shè)GD/R聯(lián)合ATP處理BV2細(xì)胞,并提取細(xì)胞上清中的外泌體,以Western blotting檢測(cè)外泌體中NAMPT量的釋放量變化。研究結(jié)果:第一部分小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的NAMPT對(duì)腦缺血慢性期炎癥的調(diào)控作用及其作用機(jī)制在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,NAMPT抑制劑FK866(10 nM)側(cè)腦室預(yù)給藥可改善局灶性腦缺血再灌注(MCAO1 h/R 14 d)所致的大鼠神經(jīng)功能下降,減小腦梗死體積,提高神經(jīng)元存活率,抑制膠質(zhì)疤痕形成,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和增殖;在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞上,離體缺血條件——缺糖缺氧再恢復(fù)(OGD1 h/R24h)可誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞激活并伴隨NAMPT上調(diào)表達(dá);FK866(1 nM)預(yù)處理可抑制OGD 1 h/R24 h誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變圓和激活;在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞上,FK866(0.001-1 nM)抑制OGD 1 h/R24 h誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞形態(tài)變圓及 TNF-α、NAMPT、IL-6 的釋放;FK866 可逆轉(zhuǎn) OGD1 h/R 0-24 h 誘導(dǎo) BV2 細(xì)胞的M1型極化的標(biāo)記分子TNF-α、IL-6的mRNA的表達(dá)上調(diào)和M2型極化的標(biāo)記分子CD206、Arg-1的mRNA的表達(dá)下調(diào)水平;FK866(1 nM)可顯著抑制OGD1 h/R24 h誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NF-κB核移位;NF-κB的抑制劑PDTC(50 μ)可部分逆轉(zhuǎn)OGD1 h/R24 h誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。第二部分缺血和炎癥條件下小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NAMPT的出胞途徑及其影響因素OGD/R處理可誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)釋放NAMPT;免疫熒光染色結(jié)果表明,NAMPT與溶酶體、自噬體、內(nèi)體無(wú)共定位;以O(shè)GD/R或TNFα處理BV2細(xì)胞后,NAMPT在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生移位(向胞膜下分布),而OGD/R或TNFα合并應(yīng)用ATP能使細(xì)胞表面"長(zhǎng)出"有大量NAMPT陽(yáng)性的小囊泡;對(duì)以透射電鏡獲取這些囊泡的照片,進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大部分小泡直徑在100 nm左右,與外泌體的大小相符;免疫電鏡結(jié)果可確證BV2細(xì)胞釋放的,這些外泌體很多是NAMPT陽(yáng)性的;以超速離心收集這些外泌體,并進(jìn)一步做免疫印跡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NAMPT在外泌體中大量表達(dá);這充分說(shuō)明,BV2細(xì)胞通過(guò)外泌體釋放NAMPT;我們還發(fā)現(xiàn)磷脂酶D抑制劑1-butanol能夠抑制NAMPT通過(guò)外泌體釋放,說(shuō)明磷脂酶D參與調(diào)控NAMPT的釋放。結(jié)論:1.腦缺血后期小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)并釋放NAMPT;抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的NAMPT可通過(guò)逆轉(zhuǎn)腦缺血誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活,而減輕腦缺血后期小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。2.缺血和炎癥條件可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)外泌體途徑主動(dòng)釋放NAMPT,且磷脂酶D參與調(diào)控NAMPT的釋放。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陸華寶,李林;腦巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷修復(fù)中的作用[J];中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐;2002年03期

2 杜一星,王偉;小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與調(diào)控[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腦血管疾病分冊(cè));2004年08期

3 李小媚;李愛(ài)萍;;小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和功能[J];解剖學(xué)研究;2010年03期

4 楊逢春;顯示小膠質(zhì)細(xì)胞方法的改進(jìn)[J];解剖學(xué)研究;2002年02期

5 袁瓊蘭,郭勇,王瓊,鄧?yán)?高小青,余鴻,古元;小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、分離、純化和鑒定的初步研究[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年05期

6 劉鋒,朱長(zhǎng)庚;小膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子機(jī)制[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2003年02期

7 蔣平,彭艷,倪健,向正華,焦炳華;小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組三維分離方法的建立[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年06期

8 熊懷林,范光碧,胡興宇;小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中的作用[J];四川解剖學(xué)雜志;2005年02期

9 魏桂榮,張敏,董繼華,梅元武,劉仁剛;構(gòu)建一種高產(chǎn)量小膠質(zhì)細(xì)胞體外純化培養(yǎng)的方法(英文)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年21期

10 趙洋;孫素真;;小膠質(zhì)細(xì)胞和癲癇[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2008年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 韓書(shū)珍;李雪梅;牛文澤;陳翔;王果;李澤宜;;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察大鼠局灶性腦缺血半暗區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及意義[A];第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)班論文匯編[C];2009年

2 李捷;劉勇;張蓬勃;肖新莉;呂海俠;李敏杰;康前雁;鄧美英;;大鼠局灶性腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

3 賈思遠(yuǎn);雷露雯;王克萬(wàn);王勇;;煙堿型乙酰膽堿受體在離體海馬小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)與定位[A];廣東省藥學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

4 劉鋒;朱長(zhǎng)庚;劉慶瑩;;小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其在致癇過(guò)程中的作用機(jī)制[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

5 趙天智;;血清白蛋白刺激小膠質(zhì)細(xì)胞前炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的作用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

6 趙敏;袁云;趙培園;李t，

本文編號(hào)：1612832