本文選題：腦缺血再灌注損傷　切入點：線粒體功能失調　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、目的為探討柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及其可能機制,本研究以SD大鼠為實驗對象,分別采用體外原代皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)糖氧剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/Rep)模型和大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)模型,從體外和動物模型不同角度探索柚皮素干預對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其與線粒體功能失調以及核因子E2相關因子(Nrf2)通路調控的抗氧化應激的關系,明確柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用的分子機理。二、方法體外研究實驗:1、用NES-FITC及DAPI對對數(shù)生長期的大鼠皮層神經(jīng)元細胞進行免疫熒光染色鑒定。2、SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞建立OGD/Rep模型。3、(1)用不同濃度NAR干預48h后,檢測細胞凋亡情況。(2)檢測凋亡蛋白Capase-3、bax、bcl-2、CytC蛋白和基因表達水平。(3)電鏡觀察各組線粒體結構,檢測其膜電勢和腺苷酸含量變化。(4)檢測ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。4、(1)siRNA-Nrf2、OENrf2 干擾 Nrf2 表達,行 OGD/Rep 處理,再給予80MmNAR處理48h后,檢測細胞凋亡情況。(2)檢測ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。(3)檢測Nrf2蛋白轉移情況以及其與ARE結合的情況。(4)檢測Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1蛋白和基因表達水平。體內研究實驗:1、利用線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)動物模型,給予不用濃度NAR處理,術后進行神經(jīng)行為學評分、TTC染色、腦含水量測定以及HE染色。2、給予MCAO模型不同濃度NAR處理72h后,(1)電鏡掃描觀察各組線粒體結構,檢測其膜電勢和腺苷酸含量變化;(2)檢測腦組織內ROS、MDA和GSH水平及SOD活性;(3)觀察腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況,檢測腦組織Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 蛋白表達情況,檢測 Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1基因表達情況,同時檢測Nrf2的DNA結合活力和Keap1亞硝基化情況。三、結果體外研究結果:1、與正常對照相比,模型組細胞活性低,凋亡率高,差異顯著(P0.05),與模型組對比,不同濃度NAR預處理后,細胞活性提高、凋亡率下降,NAR-H組最為顯著(P0.05)。2、與正常組比較,模型組Capase-3,bax及CytC表達上調,bcl-2表達下調(P0.05)。與模型組相比,經(jīng)過不同濃度NAR預處理后,Capase-3,bax及CytC表達下調,bcl-2表達上調。其中NAR-H組最為顯著(P0.05)。3、NAR預處理可改善線粒體形態(tài),提高其膜電位及腺苷酸合成能力,提高 SOD、GSH水平,降低 ROS、MDA水平。4、與模型組比較,轉染OENrf2組和NAR組細胞活性提高,凋亡率下降,OENrf2組最為顯著(P0.05);轉染Nrf2-siRNA組則相反(P0.05)。5、與模型組比較,轉染OENrf2組和NAR組SOD、GSH水平提高,ROS、MDA水平下降,OENrf2組最為顯著(P0.05);轉染Nrf2-siRNA組則無明顯差異(P0.05)。7、與模型組比較,轉染OENrf2組和NAR組細胞質Nrf2蛋白表達增加,而胞漿表達減少,OENrf2組最為顯著(P0.05);轉染Nrf2-siRNA組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。8、NAR誘導Nrf2表達,促進Nrf2通路下游蛋白Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表達。體內研究結果:1、NAR預處理組腦梗死面積、神經(jīng)行為學評分和腦水含量均顯著優(yōu)于模型組。2、NAR預處理組線粒體正常結構增加、膜電位增強、腺苷酸合成能力提高,氧化應激水平降低,與模型對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義。3、NAR預處理組細胞凋亡減少,提高Keap1巰基亞硝基化水平、增強Nrf2 DNA活性,激活Nrf2通路下游Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表達。四、結論柚皮素對體外細胞培養(yǎng)氧糖剝奪/再灌注模型和大鼠腦缺血再灌注模型中的神經(jīng)細胞均具有明顯的保護作用,該作用與其改善線粒體結構和功能失調以及激活Nrf2介導的抗氧化應激活性相關。
[Abstract]:First, to explore the neuroprotective effect of naringin on cerebral ischemia reperfusion injury and its possible mechanism, in this study, SD rats were used respectively in primary cultured cortical neurons of oxygen and glucose deprivation / reperfusion (oxygen and glucose deprivation/reperfusion, OGD/Rep) model and rat cerebral ischemia / reperfusion (MACO) model in vitro and animal models from different angles to explore the protective effect of naringenin intervention on cerebral ischemia reperfusion injury and mitochondrial dysfunction and nuclear factor E2 related factor (Nrf2) pathway between oxidative stress, the specific molecular mechanism of naringenin on cerebral ischemia reperfusion injury neuroprotection. Two methods in vitro experiments: 1, logarithmic growth period for the NES-FITC and DAPI in rat cortical neurons were identified by immunofluorescence staining of.2 and SD in rat cerebral cortex of God The establishment of OGD/Rep cell model of.3 (1) with different concentrations of NAR after 48h intervention, the apoptosis was detected. (2) detection of apoptosis protein Capase-3, Bax, Bcl-2, the expression level of CytC protein and gene. (3) observed in mitochondria electron microscope, to test the change of membrane potential and adenosine (4) detection. ROS, MDA and GSH level and the activity of SOD.4 (1) siRNA-Nrf2, the expression of OENrf2 interference Nrf2 OGD/Rep treating, then given 80MmNAR after 48h treatment, the apoptosis was detected. (2) detection of ROS, MDA and GSH level and SOD activity. (3) the detection of Nrf2 protein and ARE and its transfer (4). Combined detection of Nrf2, Keap1, HO-1 and NOQ1 protein level and gene expression. In vivo experiment: 1, using the suture method in rats cerebral ischemia reperfusion (MCAO) animal model, give no concentration NAR treatment, postoperative neurobehavioral score, TTC staining, content determination with the brain .2 and HE staining, MCAO 72h model to deal with different concentrations of NAR (1), scanning electron microscope to observe the structure of mitochondria, to test the change of membrane potential and adenylate content; (2) detection in the brain tissue of ROS, MDA and GSH level and SOD activity; (3) to observe the brain tissue apoptosis of neural cells, detection of brain Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1 protein expression, Nrf2 detection, Keap1, HO-1, NQO1 gene expression, and detection of Nrf2 DNA binding activity and Keap1 nitrosylation. Three results in vitro results: 1, compared with the normal control, model group cell activity is low, the apoptosis rate is high, significant difference (P0.05), compared with the model group, different concentration of NAR after pretreatment, cell activity increased, apoptosis rate decreased, NAR-H group (P0.05.2), compared with the normal group, Capase-3 model group, expression of Bax and CytC, bcl-2 expression (P0.05). Compared with the model group, after different concentration The degree of NAR after pretreatment, Capase-3, Bax and CytC expression, bcl-2 expression. The NAR-H group (P0.05.3), NAR preconditioning can improve mitochondrial morphology, membrane potential and improve their ability to improve SOD, adenylate synthesis, reduce ROS, GSH level, MDA level of.4, compared with the model group to improve the transfection of OENrf2 group and NAR group cell activity, decreased apoptosis rate, OENrf2 group (P0.05); transfection group Nrf2-siRNA (P0.05) in.5, compared with the model group, OENrf2 transfection group and NAR group SOD, GSH level, ROS, MDA decreased, OENrf2 group (P0.05); there was no obvious difference between the transfected Nrf2-siRNA group (P0.05.7), compared with the model group, OENrf2 transfection group and NAR group of cytoplasmic Nrf2 protein expression increased and cytoplasmic expression decreased, OENrf2 group (P0.05); there was no significant difference in transfection group Nrf2-siRNA (P0.05).8, Nrf2 induced expression of NAR, promote Nrf2 pathway The downstream protein Nrf2, Keap1, HO-1 and NOQ1 expression in vivo. Results: 1, NAR pretreatment group infarct size, neurological behaviors and brain water content were significantly better than the.2 model group, NAR pretreatment group increased mitochondrial membrane potential of normal structure, enhance, improve the level of oxidative stress adenylate synthesis ability, lower than with the model group, the difference was statistically significant.3, NAR pretreatment group to reduce cell apoptosis, improve Keap1 S-nitrosylation level, Nrf2 enhanced DNA activity, activation of the Nrf2 pathway downstream of Nrf2, Keap1, HO-1 and NOQ1 expression. Four, the conclusion of naringenin on cultured cells of oxygen glucose deprivation / reperfusion model rats cerebral ischemia reperfusion model in nerve cells has a significant protective effect, and the effect of improving the structure and function of mitochondria dysfunction and activation of Nrf2 mediated activation of oxidative stress.

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743

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本文編號：1602624